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动物细胞原代培养技术演讲人：日期:

目录CONTENTS01实验准备阶段02组织取材规范03细胞分离方法04原代培养体系05细胞鉴定标准06常见问题处理

01实验准备阶段

材料与器械灭菌处理操作空间灭菌实验前需对操作台、空气等环境进行紫外线照射或喷洒灭菌剂，以保证操作空间的无菌状态。03培养基、血清、生理盐水等需经过滤菌处理，确保无菌状态。02材料灭菌器械灭菌手术刀、手术剪、镊子、培养皿等器械需经过高温高压蒸汽灭菌或化学浸泡灭菌。01

培养设备参数校准包括温度、湿度、气体浓度等参数的校准，确保培养环境稳定且符合细胞生长要求。培养箱参数校准调整显微镜的焦距、光线等参数，确保观察细胞时图像清晰。显微镜校准校准离心机的转速和时间，确保细胞分离和纯化处理的效果。离心机参数校准

培养基与试剂配制培养基配制根据细胞类型和实验需求，选择合适的培养基配方，并按照说明书进行配制。01试剂添加在培养基中加入所需的生长因子、激素、抗生素等试剂，确保细胞在培养过程中的正常生长和分裂。02pH值调整使用pH计检测培养基的pH值，并通过添加酸碱溶液进行调整，确保pH值在细胞生长的最适范围内。03

02组织取材规范

样本来源选择标准新鲜度种类与部位健康状况年龄与性别选择尽可能新鲜的样本，避免细胞在取材前的死亡或变异。根据实验需求选择特定种类和部位的组织，确保细胞具有代表性。确保取材的动物处于健康状态，避免疾病对细胞的影响。考虑年龄和性别对细胞特性的影响，选择适当的样本。

无菌操作技术要点6px6px6px使用前对手术器械进行彻底灭菌，防止细菌、病毒等微生物污染。器械灭菌遵循无菌操作规程，避免交叉污染和样本污染。无菌操作手法在无菌室或超净工作台中进行操作，确保操作环境的洁净度。操作环境010302取样后迅速将样本放入无菌容器中，避免暴露在空气中。样本保护04

清洗用无菌生理盐水或缓冲液清洗组织块，去除表面附着的血液、体液和杂质。剪切与研磨将组织块剪切成适当大小，用研磨器或匀浆器将其研磨成细胞悬液。过滤用细胞筛或滤网过滤掉组织碎片和杂质，获得纯净的细胞悬液。细胞计数与调整对细胞进行计数，并根据实验需求调整细胞浓度和活力。组织块预处理步骤

03细胞分离方法

根据待分离的细胞类型和特性，选择适当的酶种类和浓度，如胰蛋白酶、胶原蛋白酶等。将酶溶解于适当的缓冲液中，调节pH值和离子强度，以保证酶的活性。将待分离的细胞置于酶液中，在适宜的温度和pH条件下进行消化，使细胞间的蛋白质分解，细胞分离。加入适量的酶抑制剂或培养液，终止酶的消化作用，保护细胞不受损伤。酶消化法操作流程选择合适的酶配制酶液细胞消化终止消化

机械分离实施策略切割法利用手术刀、剪刀等器械将组织切割成小块，再通过其他方法进一步分离细胞。01刮除法用刮勺或细胞刮刀轻轻刮擦组织表面，将细胞刮下并收集。02研磨法将组织放入研钵或研磨器中，加入适量的缓冲液，用研杵进行研磨，使细胞分离。03过滤法通过细胞筛或滤网将细胞团块和杂质过滤掉，获得单个细胞悬液。04

细胞悬液过滤纯化过滤法免疫磁珠法离心法流式细胞术将细胞悬液通过细胞筛、滤网或无菌滤器等设备，去除杂质和细胞团块，获得纯净的细胞悬液。将细胞悬液置于离心管中，以适当的转速和时间进行离心，使细胞与杂质分离。利用特异性抗体与细胞表面的抗原结合，通过磁珠的吸附作用，将目标细胞从细胞悬液中分离出来。利用细胞在流动状态下的物理和化学特性，对细胞进行分离和纯化。

04原代培养体系

培养基选择原则营养丰富平衡盐浓度适宜的pH值添加生长因子含有细胞生长和增殖所需的各种营养成分，如氨基酸、维生素、无机盐等。细胞内外渗透压平衡的关键，对细胞生长和代谢至关重要。细胞生长和增殖的适宜pH范围，通常为7.2-7.4。有些细胞需要特定的生长因子才能生长和增殖。

培养环境参数控制温度细胞生长和增殖的适宜温度通常为37℃，需要保持恒温度细胞培养箱内保持一定的湿度有助于细胞生长和增殖，通常为95%左右。气体环境细胞需要氧气和二氧化碳进行呼吸和代谢，通常采用95%空气和5%二氧化碳的气体环境。光照有些细胞需要光照才能生长，而有些则需要避光，需根据细胞特性进行光照控制。

污染预防措施无菌操作进行细胞培养时必须严格遵循无菌操作规程，防止微生物污染。01消毒和灭菌所有进入细胞培养环境的物品和试剂必须经过严格的消毒和灭菌处理。02空气净化细胞培养箱内的空气必须经过高效过滤，去除空气中的微生物和微粒。03定期检测定期对细胞培养环境进行微生物检测，确保培养环境的洁净度。04

05细胞鉴定标准

形态学观察指标细胞形态生长特性细胞结构增殖能力细胞呈多边形、梭形、铺路石样等，具有相应细胞的特征。细胞核清晰、核仁明显，胞质丰富，线粒体等细胞器可见。细胞贴壁生长，具有铺路石样排列，细胞间连接紧密。细