苦丁茶中熊果酸的大孔树脂分离纯化工艺研究.docxVIP

摘?要：以苦丁茶为研究对象，采用大孔吸附树脂对苦丁茶中熊果酸的粗提取物进行分离纯化。对4种不同型号的大孔吸附树脂进行静态实验考察，筛选出最佳树脂，并以该树脂对苦丁茶中的熊果酸进行动态吸附及洗脱性能的研究，优化大孔树脂分离熊果酸的工艺参数。实验筛选出了以HZ-816型树脂为上样树脂，该树脂纯化熊果酸的优化工艺条件为：吸附流速4BV/h，上样浓度1.40mg/mL，上样体积225mL，树脂吸附量可达18.697mg/g；以90%乙醇为洗脱剂，洗脱流速4BV/h，洗脱剂用量10BV，解吸率可达58.57%，再减压浓缩解吸液得干膏，纯度为48.26%。

关键词：苦丁茶；熊果酸；大孔树脂；分离纯化；吸附；解吸

0?引言

苦丁茶，别称茶丁、富丁茶。苦丁茶中含有多种活性成分，如维生素、氨基酸、挥发油、黄酮类化合物、微量元素以及多酚类物质等。其味苦、性凉，具有生津止渴、清热消暑、抑癌防癌、活化血脉等多种生物学效应。

熊果酸（UA），又名乌苏酸，属于五环三萜类化合物。在自然界中分布较广，如在女贞、熊果、枇杷和毛泡桐等天然植物中均有一定含量存在。熊果酸纯品为白色或类白色针状晶体或结晶粉末。熊果酸本身具有多种很强的开发价值，比如具备抑制肿瘤、抗炎镇静、保护肝脏损伤、抗糖尿病、抑制细菌活性、抗病毒传播等药理作用。

目前，广泛应用于熊果酸分离纯化的方法有：硅胶柱色谱吸附及分步洗脱法和有机溶剂萃取法。然而，上述方法均存在工艺流程复杂、收率低，且使用的有机溶剂有毒有害等问题。大孔树脂分离技术，具有工作效率高、吸附容量大、可再生等诸多优点，且采用乙醇作为溶剂进行梯度洗脱，所得产物绿色环保，安全性高，已逐步在中药制药工艺中得到应用。

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1?材料与方法

1.1?实验材料与试剂

实验材料与试剂如表1所示。

1.2?实验仪器与设备

实验仪器与设备如表2所示。

1.3?分析方法

本实验参照2015版《中国药典》记载的熊果酸含量测定方法，以熊果酸标准品为对照品，应用香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法，以紫外-可见分光光度法为分析手段，测定熊果酸含量。

1.3.1?检测波长的确定

精密称取熊果酸标准品，配成质量浓度为0.1mg/mL的熊果酸标准品溶液。分别吸取一定量的熊果酸标准品溶液和苦丁茶提取液，置于20mL具塞刻度试管中，于105?℃下挥发溶剂后，准确加入5%香草醛-冰醋酸溶液200μL，振荡摇匀；再加入高氯酸试液800μL，摇匀，置于60?℃水浴中加热15min，用冰醋酸定容至5mL，并置于紫外-可见分光光度计中进行波长扫描，得到熊果酸的检测波长为548nm。

1.3.2?标准曲线的建立

精密吸取各对照品溶液0μL、100μL、200μL、300μL、400μL、500μL、600μL，分别置于20mL具塞刻度试管中，按1.3.1项操作，在548nm波长处测定熊果酸溶液吸光度，得标准曲线方程：A=0.0423C+0.0036，线性浓度范围0～12μg/mL，R2=0.9993。表明在该浓度范围内，熊果酸浓度C与吸光度值A具有良好的线性关系。

1.4?分离方法

1.4.1?树脂预处理

（1）用去离子水冲洗树脂，以去除其表面的盐和无效物质；

（2）使用95%乙醇浸泡树脂24h；

（3）过滤除去浸泡用的乙醇溶液后再进行醇洗，直到树脂与去离子水以1:3混合不显浑浊为止；

（4）用蒸馏水洗至树脂无乙醇气味；

（5）用5%的HCl过柱，浸泡树脂3h左右，水洗至中性；

（6）用2%的NaOH过柱，浸泡树脂3h左右，水洗至中性后备用。

1.4.2?树脂性能参数

本实验使用4种不同型号的大孔吸附树脂对苦丁茶中的熊果酸进行纯化性能研究，其主要性能指标如表3所示。

1.4.3?静态筛选实验

分别精确称取经过预处理后的HZ-806、HZ-816、HZ-818、HZ-826这4种大孔树脂1.0g，转移至100mL的三角烧瓶中，向三角烧瓶中加入50mL浓度为1.002mg/mL的苦丁茶熊果酸提取液进行吸附，每隔10min振摇30s，持续2h，静置24h，使其达到吸附平衡，计算吸附量及其吸附率。

1.4.4?动态吸附及解吸实验

准确称取经过预处理的树脂，通过湿法上样的方式，装入树脂柱中；将一定浓度的熊果酸提取液注入柱内，控制流速，使其通过树脂；收集流出液，并用紫外-可见分光光度法测定熊果酸浓度。在洗脱过程中，解吸液从树脂柱的上端向下端流动，控制解吸液的流动速度，使用采样瓶收集流出液，并用紫外-可见分光光度法测定熊果酸浓度。计算吸附率、吸附量和解吸率。

1.4.5?纯度测定

首先，收集优化工艺条件下的苦丁茶熊果酸解吸液，测定其吸光度，根据苦丁茶熊果酸标准曲线方程，计算解吸液中苦丁茶熊果酸的含量。然后，减压浓缩解吸液至