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Westernblot实验技术

一、原理

WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针是抗体，“显色用标记的二抗。

通过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白

质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载为上的蛋白质或多肽作为抗原，与相应的抗体

起免疫反映，再与酶、荧光或同位素标记的第二抗体起反映，通过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异

性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

WesternBlot操作美健步！|

1.组织采集或如附焙养

2.样备

3.SDS

4.转腰

5.一杭的累育

6.二抗的舒育

7.£B

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WesternBiol按实验环节分重要涉及两部分：①SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳重（要目的为按分子量大

小对蛋白质进行分离）；②Western印迹在（韧性支持物上通过抗原抗体杂交后的显色强弱反映

蛋白丰度）。

LSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：

该技术一方面在1967年由ShapirO建立，1969年由webei■和Osbom进一步完善。

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺简（称Acr）和交联剂N,N一亚甲基双丙烯酰胺简（称Bis）在催化

剂过硫酸钱（AP）,N,N,N，N四甲基乙二胺（TEED）作用下，聚合交联向成的具有网状立体结

构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电冰可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同

迁移率将蛋白质分离成若干条区带，假如分离纯化的样品中只具有同一种蛋白质，蛋白质样品电

泳后，就应只分离出一条区带。SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按

一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其自身原有的电荷，掩

盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质SDS复合物在电泳时的迁移率，不再受

原有电荷和分子形的影响。这种电泳方法称为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDS—PAGE)。由

于SDSPAGE可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的限度，因此

常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化限度，假如被鉴定的蛋m质样品很纯，只具有一种具三级结构

的蛋白质或具有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE后，就只出现一条蛋

白质区带。