稳转细胞株构建全攻略：从理论到实践的生物制药核心技术解析.pdf

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稳转细胞株构建全攻略：从理论到实践的生

物制药核心技术解析

为何稳转细胞株成为生物制药领域的“兵家必争之地”？

稳转细胞株被称为“药物研发的基石”，是单克隆抗体、双抗、疫苗、

ADC等生物制品规模化生产的核心环节，还是药物生产成本、效率和

质量的关键决定因素。一株高产稳定的细胞株有可能直接缩短药物上

市周期3-5年。稳定细胞株因其稳定性高，适用于各种研究应用，包

括重组蛋白、抗体生产、结构生物学和功能性研究等。

那么，如何打造一株理想的稳转细胞株呢？

义翘神州在重组表达方面不断深耕，积累了大量稳定株开发的相关经

验，在提高稳定细胞株的生产能力、改善细胞状态等方面有着丰富的

经验。义翘神州可提供从基因合成到稳定细胞株交付的一站式服务，

为客户的研究提供助力。

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稳转细胞株构建全流程：从载体设计到单克隆筛选

稳转细胞株是指在细胞中持续稳定表达特定基因或者干扰特定基因

表达的细胞株。与瞬时转染相比，稳转细胞株便于长期观察基因对于

细胞功能的影响及蛋白相互作用，尤其适合于体内实验。稳转细胞株

将外源基因克隆至含有某种筛选标记的载体上，将载体转染目的细胞

并整合到染色体中，利用载体携带的筛选标记进行筛选，从而得到可

稳定表达目的基因的细胞株。

稳转细胞株的构建通常包含：载体构建、转染、Pool筛选、克隆筛

选、PCB建库、MCB/WCB建库、细胞株稳定性研究等内容。

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生产用稳转细胞株的构建首先从表达载体构建和细胞转染开始。

首先，转染过程是将表达目的蛋白的基因整合到载体中，再将该载体

转染至宿主细胞内。表达水平与基因拷贝数、基因整合位点的转录活

性有关。常用的转染方式有钙转、电转、脂质体转染、逆转录病毒转

染等。

常用的宿主细胞是CHO。CHO细胞种类多样，包括CHO-K1、CHO-S、

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CH-DG44、CHOZN-GS、CHO-K1SV、CHO-K1SVGS-KO、CHO-K1GS等。

不同的CHO宿主细胞在细胞株构建中的表现各异。

接着，采用不同的筛选试剂获得正确高效表达目的基因的细胞池

（Pool）。

为了更高效地筛选出高表达水平的稳转细胞株，表达载体上除了包含

蛋白本身的基因以外，往往还含有各种筛选标记。筛选标记一般可以

被分为两大类：一类是以G418为代表的抗生素类筛选标记；另一类

是以MTX为代表的细胞代谢筛选标记。

不同种类的筛选标记（源自文献：DOI:10.4161/mabs.2.5.12720）

当目的基因被转染到宿主细胞内，按照一定的细胞密度在合适的筛选

压力下进行传代培养后便可获得细胞池（Pool）。针对不同的宿主细

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胞可以采取不同的Pool筛选方式。例如：采用摇瓶进行大规模Pool

筛选，或采用孔板进行迷你Pool筛选。Pool的表达量取决于转染的

方式、筛选压力以及目的基因整合情况。

对于不同的目的蛋白分子，在Pool阶段需要考察的标准不同。例如：

对于常规新药抗体，往往表达量为第一评价标准；对于生物类似物，

在Pool阶段则需着重考察各项质量参数与原研药的差异；对于双特

异性抗体，在此阶段需开始考察正确装配的比例，以期降低克隆筛选

阶段的风险。

细胞池Pool中的每个细胞特性各异，具有不同的基因整合位点、拷

贝数、生长速率等，因此需将其中具有高产、稳定表达特性的细胞个

体分离出来分别