流式细胞术实验步骤.pptxVIP

演讲人：日期:流式细胞术实验步骤

目录CONTENTS02.04.05.01.03.06.样本制备数据采集仪器准备结果分析染色处理注意事项

01样本制备

样本类型与预处理根据实验目的选择合适的样本类型，如组织、细胞悬液、血液等。样本类型去除样本中的杂质和凝块，如使用过滤、离心等方法。预处理对于组织样本，需利用酶解法或机械法将细胞从组织中分离出来。细胞分离

细胞悬液制备方法细胞活力检测采用台盼蓝染色等方法检测细胞活力，保证实验结果的准确性。03使用细胞计数仪或显微镜进行细胞计数，确保细胞悬液的浓度适宜。02细胞计数悬液制备将分离得到的细胞用适当的缓冲液稀释，制备成细胞悬液。01

样本保存与质量控制保存条件细胞悬液需保存在适当的温度、湿度和气体环境下，以保持细胞活性。01防腐剂使用如需长时间保存，可加入适量的防腐剂，如叠氮化钠等。02质量控制定期进行样本质量检测，如细胞形态、活力、纯度等，确保实验数据的可靠性。03

02仪器准备

流式细胞仪开机校准流式细胞仪开机后需进行预热，以确保仪器达到最佳工作状态，通常需要预热30分钟以上。仪器预热激光校准液流校准使用标准荧光微球进行激光校准，确保激光光源的准确性和稳定性。使用标准液流微球进行液流校准，确保液流系统的稳定性和准确性。

荧光通道设置根据实验需要，设置相应的荧光通道，包括荧光素的激发波长和发射波长。电压调节根据荧光微球的荧光强度，调节电压使荧光信号在适当的范围内。补偿调节消除不同荧光素之间的信号干扰，进行荧光补偿调节。阈值设置根据实验要求，设置适当的阈值，以区分背景信号和有效信号。光路与电压参数设置

质控微球验证流程6px6px6px使用特定的质控微球进行验证，确保微球的均匀性和稳定性。验证微球准备多次检测质控微球，验证仪器的重复性和可靠性。验证仪器重复性通过检测质控微球的荧光信号，验证光路的稳定性和准确性。验证光路稳定性010302根据验证结果，判断仪器是否处于最佳工作状态，并进行必要的调整和维护。验证结果分析04

03染色处理

选择与目标细胞表面或细胞内特定抗原结合的抗体，确保高特异性和低非特异性背景。根据实验需求选择合适的标记物，如荧光染料、酶、生物素等，确保标记物对抗体无影响且检测灵敏度高。通过预实验确定最佳抗体浓度，避免抗体过量或不足导致染色效果不佳。在多种抗体同时使用时，需确保各抗体之间不会相互干扰或产生交叉反应。抗体选择与标记方案抗体特异性标记物选择抗体浓度抗体组合

染色孵育条件优化孵育温度孵育时间缓冲液选择细胞浓度与悬液根据抗体和标记物的特性，选择合适的孵育温度，通常为室温或37℃。确定最佳孵育时间，使抗体与细胞充分结合，同时避免过长时间的孵育导致非特异性结合增加。选择适当的缓冲液，保持细胞形态和抗体活性，同时避免细胞聚集或裂解。调整细胞浓度和悬液的组成，确保细胞在染色过程中保持良好的分散状态。

阴性对照补偿设置设置阴性对照以评估非特异性染色和背景水平，通常使用同种型对照抗体或不加抗体的细胞悬液。在多色染色实验中，需进行荧光补偿调节，以消除不同荧光染料之间的光谱重叠和相互干扰。阴性对照与补偿设置阳性对照设置阳性对照以验证染色方法和抗体的有效性，通常使用已知表达目标抗原的细胞或组织。样本检测在正式实验前，先对样本进行检测，确保染色效果和仪器参数设置合适，避免实验结果的误判。

04数据采集

阈值与信号采集范围01阈值设定根据实验需求，设定适当的阈值，以区分背景噪声和有效信号。02信号采集范围根据样本特性，选择合适的信号采集范围，避免过度采集或遗漏重要信号。

细胞分选流速控制流速稳定性确保细胞分选流速稳定，避免细胞在分选过程中受损或丢失。01流速调节根据实验需求，调节细胞分选流速，以获取所需的细胞数量。02

原始数据文件保存选择适当的原始数据文件格式，以便后续分析和处理。数据格式对原始数据文件进行备份，以防数据丢失或损坏。数据备份确保原始数据文件的保密性，避免数据泄露或被篡改。数据保密性

05结果分析

分析软件基础操作数据导入参数设置图形显示数据导出将流式细胞仪采集的数据导入分析软件。根据实验需求，设置分析参数和门限值。通过软件生成直方图、散点图等图形，展示细胞分布情况。将分析结果导出为Excel或PDF格式，便于后续处理和查看。

统计目标细胞群的数量，并计算占总细胞的比例。细胞计数针对特定标记，对目标细胞群进行亚群分析。细胞亚群分过不同参数设置，识别出目标细胞群。细胞群识别计算各细胞亚群之间的比例关系，分析细胞分化情况。细胞比例计算细胞群圈选与统计

多色荧光补偿校正6px6px6px理解荧光补偿的原理和作用，消除多色荧光之间的干扰。荧光补偿原理消除荧光染料之间的溢出效应，提高数据准确性。荧光溢出校正根据实验需要，调节各荧光通道之间的补偿值。补偿调节0