DB13T 5374-2021 禽烟曲霉菌病综合诊断技术规程.docxVIP

ICS65.020CCSB16

DB13

河北省地方标准

DB13/T5374—2021

禽烟曲霉菌病综合诊断技术规程

2021-04-26发布2021-05-26实施

河北省市场监督管理局发布

DB13/T5374—2021

I

前言

本文件按照GB/T1.1－2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构与起草规则》的规定起草。

本文件由河北工程大学提出。

本文件起草单位：河北工程大学。

本文件主要起草人：刘建钗、柳焕章、刘会恰、张鹤平、刘利强、刘艳莉、张良、崔国林、刘彦威、刘娜、李想、李晶晶、娄路平、李夫宏。

DB13/T5374—2021

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禽烟曲霉菌病综合诊断技术规程

1范围

本文件规定了禽烟曲霉病综合诊断技术的临床诊断、实验室诊断和综合判定。

本文件适用于鸡、鸭、鹅、鸽子、鹌鹑等禽类烟曲霉菌病的诊断及其烟曲霉菌病原的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489-2008实验室生物安全通用要求

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

GMA-Grocott：六胺银染色；

PCR：聚合酶链式反应；

PDA：马铃薯葡萄糖琼脂培养基；

PAS：过碘酸雪夫氏染色；

SYBRGreenⅠ：DNA荧光染料；

TTC：红四氮唑显色培养基；

TSA：胰蛋白胨大豆琼脂培养基；

YEPD：酵母浸出粉胨葡萄糖培养基。

4临床诊断

当禽出现以下部分或全部情形时，可作为初步诊断的依据。

4.1临床症状

各日龄禽均可感染，雏禽易感。病禽眼神呆滞、眯眼、呼吸困难等症状。

4.2剖检病变

肺脏发生不同程度坏死、气囊增厚、出现黄色菌斑并偶而伴有肝脏出血斑或颜色暗红。

5实验室诊断

包括常规检测和定量PCR检测技术。参照GB19489-2008实验室生物安全通用要求的相关条款。

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5.1常规检测

5.1.1样品的采集

取病禽肺、肝脏、肾等病料，放入无菌的平皿中；其他器官用无菌剪刀各取小块组织两份，用灭菌水充分冲洗后，一份接种于YEPD平板上（1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%琼脂粉），一份放入40g/L甲醛固定液中待用。

5.1.2病原菌的分离纯化与形态观察

将接种病料的平板放入培养箱，28℃恒温培养，每天观察菌落生长情况；3d后用接种环挑取平板上的疑似菌落，划线接种于YEPD平板培养基继续分离培养，3d后将疑似单菌落进行涂片、染色和镜检，取疑似菌落菌体进一步接种于PDA试管斜面，28℃培养3d后保存备用。

对照烟曲霉菌典型菌落形态和菌体形态特征进行初步鉴别（参见附录A）。

5.1.3组织切片检查

将40g/L甲醛固定液中样本固定24h后取出，经修块、脱水、透明、浸蜡包埋、切片、HE染色、PAS、GMA和CFW染色，显微镜观察组织病理和病原生长情况（参见附录A）。

以病料中检查到菌丝或孢子为阳性结果，病料中连续两次检查不到菌丝和孢子为阴性。

5.1.4不同染色方法检查

分离株（经形态学和分子生物学鉴定），进行鸡体攻毒试验。并对HE、PAS、GMS、CFW四种染色方法进行了组织学对比观察（参见附录A）。

5.1.5CSP基因分型

分离株（经形态学和分子生物学鉴定），进行CSP基因分型，已确定感染烟曲霉菌的基因型（参见附录A）。

5.2定量PCR检测

5.2.1样品采集

选择有典型症状的病禽，无菌采血或病变组织（肺），放入1.5mL灭菌EP管中，将EP管编号，记录样本信息，-20℃保存备用。

5.2.2基因组DNA提取

取组织样本0.2g放在研钵中，加入适量液氮，待液氮即将挥发殆尽时迅速研磨成粉末状，收集样本0.05g～0.1g于1.5mLEP管中，加入500μL裂解液（400mMTris-HCl[pH8.0]，60mMEDTA[pH8.0]，150mMNaCl，1%sodiumdodecylsulfate），室温放置10min；加150μL乙酸钾(pH4.8)，漩涡震荡，离心12000g，1min，取上清液放入新试管，加入等体积异丙醇；DNA团块用70%乙醇清洗，干燥后，溶解在50μLTE（10mMTris，1mMEDTA）中保存。

5.2.3引