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基本实验技术PART1

内容提要基本实验技术和方法细胞培养MTT划痕修复westernblotsiRNA如何把实验做好（心得体会）

一、基本实验技术和方法（一）细胞培养1培养细胞的特性培养细胞的生长方式贴附生长：贴附于支持物表面悬浮生长：于悬浮状态下即可生长

游离期贴壁期

潜伏期对数生长期停止期（平台期）

培养细胞生长的条件细胞的营养需要（血清质量好坏是实验成败的关键）细胞的生存环境温度:37℃O220%CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-渗透压无污染无毒

2.四唑盐（MTT）比色法原理：活细胞线粒体脱氢酶可溶性的四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。

预实验OD:0.8—1.2有效值（线性范围）吸光度与所含的formazan量成正比细胞点板量的确定（保证所测的con值在0.8-1.2之间）不同的细胞株不同不同的时间点不同

每孔细胞量24h48h30000.40.550000.60.780000.80.91000011120001.11.1150001.21.2200001.31.4

细胞计数×104个/ml每孔点板100μl给药100μl

添加标题操作步骤添加标题单细胞悬液接种于96孔培养板；8000个细胞/孔，每孔培养基总量200微升（100+100），37℃、5％添加标题CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）添加标题加入2毫克／毫升的MTT液（20微升／孔）；继续培养3小时。添加标题吸出孔内培养液后，加入DMSO液（100微升／孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。添加标题酶标仪检测各孔OD值（检测波长570nM）。记录结果，绘制

点板注意事项01蛇行点板十字交叉02给药方向03点板方向

计算抑制率，公式[（对照-本底）-（给药-本底）]/（对照-本底）*100%.直接比较各组OD值

3.划痕修复实验（woundhealing）原理：肿瘤细胞运动特性之一：侧向迁移能力借鉴体外细胞至伤愈合模型，在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后观察处理后细胞迁移的能力0h24hCon(10%血清)给药

实验步骤单击此处添加小标题细胞点板，具体数量因细胞不同而不同，并根据给药时间和条件来定。单击此处添加小标题第二天用枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，枪头要垂直，不要倾斜。单击此处添加小标题用PBS洗细胞3次，去除划落的细胞，加入培养基。单击此处添加小标题放入37℃5%CO2培养箱培养。按0、6、12、24小时取样，拍照。

实验要点划痕质量宽度笔直程度划痕后一定要清洗干净

结果处理Part1Part2

4.Westernblot原理：经过电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体抗原抗体反应先分离后分析蛋白含量或者表达、存在形式的变化

实验步骤单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，为了演示发布的良好效果，请言简意赅地阐述您的观点。转膜单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，为了演示发布的良好效果，请言简意赅地阐述您的观点。封闭单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，为了演示发布的良好效果，请言简意赅地阐述您的观点。二抗杂交蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳底物显色单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，为了演示发布的良好效果，请言简意赅地阐述您的观点。一抗杂交

实验要点上样量蛋白KD数制胶：上层胶和下层胶的比例上层胶不能有碎胶泳道笔直加样前样品应先离心,尤其是长时间放置的样品,以减少蛋白质带的拖尾现象转膜：成功的关键保证时间不同厚度的胶最好不要一起转

单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，为了演示发布的良好效果，请言简意赅地阐述您的观点。合适一抗浓度单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，为了演示发布的良好效果，请言简意赅地阐述您的观点。低：没有条带或条带不清晰样品缓冲液中煮沸的样品可在-20℃存放数月,但是反复冻融会使蛋白质降解高：非特异性结合杂带030201

5.siRNA添加标题原理添加标题dsRNA的剪切RISC的形成siRNA介导的RISC对mRNA的剪切作用

RISC（RNA-inducedsilencingplex）

siRNA基因沉默实验设计02转染siRNA到靶细胞瞬时表达——化学合成siRNA，质粒表达siRNA稳定表达——质粒表达siRNA03分析检测RNA干扰作用蛋白水平:WB/IF/FCmRNA水平:RT-PCR、northernblotting选择、设计、合成s