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生物细胞工程核心流程

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CONTENTS

01

细胞培养基础

02

基因编辑技术

03

细胞融合与筛选

04

产物提取与纯化

05

质量控制体系

06

工程化应用案例

01

细胞培养基础

原代培养

直接从生物体内获取细胞、组织或器官进行培养的方法。

优点

细胞生物学特性更接近体内，实验结果更接近真实。

缺点

细胞增殖能力有限，培养过程中易受污染。

传代培养

将原代培养的细胞进行传代，以获得更多细胞的方法。

01

02

03

04

优点

细胞增殖能力强，可大量扩增。

05

原代与传代培养技术

缺点

细胞生物学特性可能发生变化，实验结果可能不准确。

06

无菌操作规范

保持实验室洁净、干燥、通风，定期进行消毒处理。

实验室环境

使用前需进行高温高压灭菌处理，确保无菌。

实验器材

操作过程中需穿戴无菌实验服、手套和口罩，避免交叉污染。

实验操作

培养基配置标准

成分选择

根据细胞类型和培养目的选择合适的培养基成分。

01

配制过程

按照配方精确称量各种成分，溶解于适量的溶剂中，进行过滤除菌。

02

pH值调整

根据细胞生长需要，调整培养基的pH值至适宜范围。

03

储存条件

配置好的培养基需储存于适当的温度下，避免光照和污染。

04

02

基因编辑技术

CRISPR/Cas9系统应用

基因编辑原理

编辑效率高

适用范围广

基因编辑精确性

CRISPR/Cas9系统通过导向RNA引导Cas9核酸酶到特定基因位点进行切割，实现对基因的精准编辑。

CRISPR/Cas9技术具有较高的编辑效率，可在短时间内对多个基因进行编辑。

CRISPR/Cas9技术可应用于多种生物体，包括植物、动物和微生物等。

CRISPR/Cas9系统具有较高的基因编辑精确性，可实现对单个碱基的修改。

载体构建与转染方法

载体选择

转染方法

构建流程

筛选与鉴定

根据基因编辑的需求，选择适合的载体，如质粒、病毒载体等。

包括目的基因克隆、载体切割、连接、转化等步骤，构建出含有目的基因的载体。

将构建好的载体通过电穿孔、化学转染、病毒感染等方法导入到细胞中。

通过药物筛选、PCR、测序等方法，筛选出成功导入目的基因的细胞。

从样本中提取RNA，通过逆转录得到cDNA。

利用实时荧光定量PCR技术，对目标基因的表达量进行检测。

根据基因表达量数据，进行统计学分析，比较不同样本或不同处理条件下基因表达的差异。

通过Westernblot、免疫组化等方法，对基因表达结果进行验证，确保检测结果的准确性。

基因表达检测流程

RNA提取

基因表达定量

数据分析

结果验证

03

细胞融合与筛选

化学诱导融合原理

利用PEG的化学作用改变细胞膜结构，使细胞发生融合。

聚乙二醇（PEG）法

通过钙离子载体使细胞膜通透性增加，促使细胞融合。

钙离子载体法

利用细胞表面受体与相应配体结合，诱导细胞融合。

细胞膜表面受体诱导法

电融合技术要点

电融合仪参数设置

包括电压、电流、脉冲宽度等，影响融合效率。

01

电融合液选择

不同细胞需要不同的电融合液，以提高融合率。

02

细胞状态调整

在电融合前需对细胞进行预处理，提高融合效果。

03

杂交瘤细胞筛选标准

染色体分析

通过染色体分析确定杂交瘤细胞的遗传特性。

03

筛选出杂交瘤细胞，而非其他类型的融合细胞。

02

融合细胞筛选

特异性筛选

通过特异性抗体检测杂交瘤细胞是否具备分泌目标抗体的能力。

01

04

产物提取与纯化

离心分离技术应用

根据不同组分在离心场中的沉降速度差异进行分离。

差速离心法

密度梯度离心

离心过滤

在离心管中预先充满密度梯度介质，样品在介质中离心，不同组分因密度差异而分层。

利用离心力将液体中的悬浮颗粒分离出来，适用于去除杂质。

利用凝胶的网状结构，根据分子大小和形状进行分离。

凝胶层析

利用离子交换剂与带电分子的结合力差异进行分离。

离子交换层析

利用生物分子间的特异性亲和作用进行分离纯化。

亲和层析

层析纯化流程

膜分离工艺参数

微滤膜

孔径较大，主要用于去除细菌、微粒等较大物质。

01

超滤膜

孔径较小，可截留大分子物质，如蛋白质、酶等。

02

反渗透膜

具有极高的选择性，能有效去除溶剂、小分子物质和盐类等。

03

05

质量控制体系

细胞活性检测方法

细胞形态检查

观察细胞形态、大小、折光性等，判断细胞是否健康。

03

通过流式细胞术等方法检测细胞周期，确保细胞处于正常生长状态。

02

细胞周期检测

细胞增殖能力

检测细胞增殖能力，如MTT法等，确保细胞具备正常生理功能。

01

微生物污染排查

对细胞培养环境及终产物进行无菌试验，确保无微生物污染。

无菌试验

支原体检查

细菌内毒素检测

采用PCR、培养等方法排查支原体污染，确保细胞纯净。

检测细菌内毒素水平，确保终产物符合标准。

终