基因工程原理课件第6章基因的重组与转移.pptVIP

4.制备过程培养大肠杆菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃离心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重悬4℃离心收集菌4℃离心收集菌分装、-70℃冻存用冰冷的60mMCaCl2重悬Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重悬二、重组DNA导入大肠杆菌（1）转化（transformation)大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。（2）转染（transfection)大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。1.外源DNA导入细菌的几种方法（3）转导（transduction)借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。每?gDNA转化成功的细菌克隆数。3.转化方法2.转化率简单，但转化效率不高（106-108/?gDNA）。（1）热休克法（heatshock）转化效率高（高于109/?gDNA）。（2）电转化法10ng载体DNA100?L感受态菌Onice混合，静置10分钟42oC1分钟加入1mLLB培养基37℃摇1小时10-100?L转化液涂含抗菌素的平板吸附DNA摄入DNA（1）热休克法LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分钟，2°C离心集菌冰冷的水重悬菌体2°C离心集菌冰冷的水重悬菌体2°C离心收集菌体少量冰冷的水重悬分装成50-300?L电转仪调为2.5kV,25?F脉冲控制器200-400?0.5?g质粒DNAOnice混合加入1mLSOC培养液37°C中速震荡60分钟10-100?L转化液涂含抗菌素的平板转化（2）电转化法4.平板培养基培养细菌10-100?L转化液,涂于含抗菌素的平板,37℃过夜5.影响转化率的因素（1）重组质粒①环形质粒数环形重组质粒质粒自我连接线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。①生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。②必须在冰冷的条件下制备。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。④储存感受态菌要在-70℃以下③CaCl2处理⑤使用感受态菌时必须迅速融化融化后一般不能再次冻存使用。（2）感受态细胞（competentcells)把重组的噬菌体?DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的?噬菌体颗粒。6.体外包装的噬菌体的转导（1）体外包装（invitropackaging）（2）转导（transduction）通过受体菌细胞表面的?DNA接受器位点（receptorsite)，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32℃下培养细菌时能够保持溶源性。但当温度升高到44℃—45℃时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，?DNA复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。（3）cI857基因突变的?噬菌体但由于该噬菌体的S基因上有一个突变，所以细菌还不裂解。cI857其它基因溶源状态（?DNA不转录、不翻译）?DNA阻遏蛋白阻遏蛋白44℃—45℃?DNA转录、翻译合成外壳蛋白32℃?噬菌体1外壳蛋白基因E发生了无义突变，不能合成头部蛋白，但能合成其它外壳蛋白（尾部蛋白）。在cI857基因突变的?噬菌体的基础上，选择两种外壳蛋白的突变型?噬菌体。（4）互补型噬菌体外壳蛋白基因D发生了无义突变，不能合成头部的包装识别蛋白，但能合成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。?噬菌体2体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每?g?DNA能形成106噬菌斑）。（6）转导（5）体外包装过程转化率高的菌株；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；不育的菌株（不会与其他酵母接合）。第三节外源基因导入真核细胞一、导入酵母细胞1.菌株选择如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his3?1（1）利用原生质球进行转化2.酵母的转化方法酵母原生质体感受态酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因的酵母载体PEG（聚乙二醇）使细胞壁具有通透性CaCl2使细胞膜具有通透性转化允许DNA进入。酵母0.1mol/LLiCl处理插入外源基因的酵母载体感受态40%PEG4000（2）利用Li+盐进行转化（1）原理：二、导入哺乳动物细胞1.磷酸钙沉淀法HEPES缓冲盐水与含有氯化钙和DNA的溶液缓慢混合，会形成含磷酸钙和DNA的沉淀。依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞