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自噬在急性脊髓损伤大鼠肺组织中的变化趋势研究

引言

急性脊髓损伤（Acutespinalcordinjury，ASCI）是一种严重的中枢神经系统创伤，常导致患者出现不同程度的肢体运动和感觉功能障碍。除了脊髓局部的损伤外，ASCI还会引发一系列全身并发症，其中肺部并发症是导致患者死亡和致残的重要原因之一。自噬是一种细胞内高度保守的自我降解过程，参与维持细胞内环境稳定、清除受损细胞器和蛋白质聚集体等重要生理功能。近年来的研究表明，自噬在多种疾病的发生发展过程中发挥着重要作用。然而，自噬在急性脊髓损伤大鼠肺组织中的变化趋势及其机制尚未完全明确。本研究旨在通过建立急性脊髓损伤大鼠模型，观察自噬在肺组织中的动态变化，为深入理解急性脊髓损伤后肺部并发症的发病机制提供理论依据。

材料与方法

实验动物

选用健康成年雄性SD大鼠，体重200-250g，购自[动物供应商名称]。实验动物饲养于温度（22±2）℃、湿度（50±5）%的环境中，自由饮食和饮水，适应性饲养1周后进行实验。

主要试剂和仪器

-试剂：自噬相关蛋白LC3、Beclin-1、p62的抗体（购自[试剂供应商1]）；二抗（购自[试剂供应商2]）；苏木精-伊红（HE）染色试剂盒（购自[试剂供应商3]）；RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒（购自[试剂供应商4]）等。

-仪器：脊髓打击仪（型号：[仪器型号1]，购自[仪器供应商1]）；低温离心机（型号：[仪器型号2]，购自[仪器供应商2]）；荧光显微镜（型号：[仪器型号3]，购自[仪器供应商3]）；Westernblot相关设备（电泳仪、转膜仪等，购自[仪器供应商4]）。

急性脊髓损伤大鼠模型的建立

将大鼠随机分为假手术组和损伤组。假手术组仅暴露脊髓，不进行打击；损伤组采用改良的Allens法建立急性脊髓损伤模型。具体操作如下：大鼠经腹腔注射10%水合氯醛（350mg/kg）麻醉后，俯卧位固定于手术台上，常规消毒铺巾，取后正中切口，暴露T9-T11节段脊髓，用脊髓打击仪以[打击力度]g·cm的打击力垂直打击脊髓，造成脊髓损伤。术后常规抗感染处理，每天帮助大鼠排尿2-3次。

样本采集

分别于术后1d、3d、7d、14d，每组随机选取6只大鼠，经过量麻醉后，打开胸腔，迅速取出肺组织。一部分肺组织用4%多聚甲醛固定，用于HE染色和免疫荧光染色；另一部分肺组织立即放入液氮中速冻，然后转移至-80℃冰箱保存，用于Westernblot检测。

HE染色

将固定好的肺组织常规脱水、透明、浸蜡、包埋，制成5μm厚的切片。切片经脱蜡、水化后，用苏木精染色5-10min，水洗，盐酸酒精分化数秒，水洗返蓝，伊红染色2-3min，脱水、透明、封片，在光学显微镜下观察肺组织的病理形态学变化。

免疫荧光染色

将肺组织切片脱蜡、水化后，用0.3%TritonX-100透化15min，5%BSA封闭30min，分别加入LC3、Beclin-1的一抗，4℃孵育过夜。PBS漂洗后，加入荧光标记的二抗，室温孵育1h，DAPI复染细胞核，封片后在荧光显微镜下观察并拍照，分析自噬相关蛋白的表达情况。

Westernblot检测

取适量肺组织，加入RIPA裂解液，冰上匀浆，4℃12000r/min离心15min，取上清液，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取等量蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂牛奶封闭1h，分别加入LC3、Beclin-1、p62的一抗，4℃孵育过夜。TBST漂洗后，加入相应的二抗，室温孵育1h，ECL发光显色，用凝胶成像系统采集图像，用ImageJ软件分析蛋白条带的灰度值，以β-actin为内参，计算目的蛋白的相对表达量。

统计学分析

实验数据以均数±标准差（`x±s`）表示，采用SPSS22.0统计软件进行分析。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），若差异有统计学意义，进一步用LSD法进行两两比较。以P0.05为差异有统计学意义。

结果

肺组织病理形态学变化

-假手术组：肺组织结构清晰，肺泡壁薄，肺泡腔正常，未见明显的炎症细胞浸润和水肿等病理改变。

-损伤组：术后1d，肺组织出现轻度充血、水肿，肺泡壁增厚，可见少量炎症细胞浸润；术后3d，肺组织病变加重，充血、水肿明显，肺泡腔内可见大量渗出物，炎症细胞浸润增多；术后7d，肺组织充血、水肿有所减轻，但仍可见较多炎症细胞浸润和肺泡结构破坏；术后14d，肺组织病变逐渐缓解，炎症细胞浸润减少，肺泡结构有所恢复。

自噬相关蛋白的表达变化

-LC3：West