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显微技术

第六节各种实用研究显微镜一、相差显微镜基本原理:普通光学显微镜可以很好地观察到经固定染色的细胞显微结构，但很难观察到活的细胞显微结构。这是因为人的眼睛只在光的波长(颜色)和振幅(亮度)变化时才能观察到被检的物体，而活细胞或未经染色标本多为无色透明，当光波被通过时，其波长和振幅并没发生什么变化，所以无法辨认。为了观察活细胞的显微结构，就需要使用相差显微镜。相差显微镜与普通显微镜主要不同之处在于用环状光栏(annulardiaphragm)代替可变光栏(changeablediaphragm)，用带相板(phaseplate)的物镜(通常用“ph”标志)代替普通物镜，并带有一个合轴调中望远镜(telescope)及滤色片。

这些特殊装置能使活细胞或未经染色的标本中各部分的折射率或厚度的微小差异，产生相位差，然后利用光的衍射和干涉的原理，把相差变成振幅(明暗)之差，使人的肉眼能够辨认出来。活细胞或未染色标本虽无色透明，但其各部分的折射率和厚度还是会有微小的差异，当光波通过时，光波在各部分的滞留时间会有不同，即光程会有微小差异，因而光波的相位会发生微小的变化，其光程与相位的关系如下：1．光速与折射率关系我们知道，单色光在不同媒质中的光速C与媒质的折射率n成反比，即：C1、C2为光波在两种不同媒质的速度，Co为光在真空的速度；n1、n2为两种不同媒质的折射率，no为真空的折射率，等于1。

折射率与光的波长λ的关系因为从光的色散等实验可知，单色光经过不同媒质的频率f不变，即：λ1、λ2、λo分别为光波在两种不同媒质和真空的波长。将此式代人上式得在同一时间t内，单色光在不同媒质中所走的路程r：将此式代入最初的上式得r1、r2和ro分别为光在两种不同媒质和真空所走的路程。式中路程(r)与折射率(n)的乘积n1r1、n2r2、n0r0称为光程(opticalpath)。

在光密质中，因为n2大，所以光波走的路程r2小，即光波传播的相位在后(图1-9B)。由此可见，在同一时间t内，单色光在不同媒质中所走的路程虽然不同，但其光程却是一样的，等于光波在真空中的路程，但它们出现早晚却不一样，也就是说，其相位发生变化。在光疏质中，因为n1小，所以光波走的路程r1大，即光波传播的相位在前(图1-9A)。

其两者的光程差(δ)就是同一光波经过折射率不同的媒质发生的相位差简称为相差，即：3，衍射与干涉相位差并不为人们肉眼所识别，所以，必须利用光的衍射和干涉的现象，把相差变成振幅(明暗)之差，从而使人的肉眼能感觉出来，如果把直射光光波推迟1／4波长，使之与衍射光保持同一相位，合成波等于直射光与衍射光振幅之和，振幅增大，亮度提高，使物像亮度大于背影亮度，则称为明反差(brightcontrast)或负反差(negativecontrast)；如果推迟衍射光波1／4波长，使直射光与衍射光的相位差1／2波长，合成波振幅为两者振幅之差，物像亮度比背景暗，称为暗反差(darkcontrast)或正反差(positivecontrast)(图1—10，图1—11)。

二、暗视野显微镜基本原理暗视野显微镜是以丁达尔(Tyndall)效应为基础而设计的，它由特殊的聚光器装置而成。暗视野聚光器主要有两种类型：一种为抛物面型聚光器；另一种为心型聚光器(图1—13)。抛物面型聚光器是种具有抛物面型反射镜、中间有黑档板的聚光器，它的特点是当平行光线入射后，都反射到一个交点上，调节这个交点在标本上，当暗视野聚光器的数值孔径大于物镜的数值孔径时，照明光线不能进人物镜，只有标本的散射光线进入物镜并成像。抛物面型聚光器具有较长的工作距离，数值孔径较小，所以只能匹配数值孔径低的物镜。

心型聚光器是具有两个反射镜、中间有黑档板的聚光器。第一反射镜为心型，对球差的校正效果较好。照明光线经心型反射镜和第二反射镜两次反射后，可以产生—个数值孔径较高的空心光锥。因反射光的焦点在聚光器表面上一个距离很短，团此所用载玻片不应过厚(可用0.9-1.1mm)。心型聚光器有较高的数值孔径，可匹配数值孔径比较高的物镜。此外，暗视野聚光器还分为浸液系和干燥系两类。不同型号的显微镜配备不同数值孔径的暗视野聚光器。例如西德莱茨厂大型显微镜ORTHOPLAN有两种暗视野聚光器，一种为高数值孔径的(D1.20)油浸暗视野聚光器，另一种为中等数值孔径(D0.80)的干暗视野聚光器。前者可配合高倍油浸物镜使用，但要保证所用物镜的数值孔径不大于1.10；后者适用于中倍干物镜，其数值孔径不应大于0.70。无论是油浸系或干燥系聚光器，所用的物镜的数值孔径都要小于聚光器的数值孔径。

这些特殊的聚光器能使照明光线改变途径，不直