乙肝表面抗原定量测定的方法学验证.docVIP

乙肝外表抗原的ELISA法定量分析

方法学验证

姓名ZP

学号0925400072

班级09级医学检验本科二班

指导老师沈富兵

二〇一三年四月

乙肝外表抗原定量测定的方法学验证

ZP〔成都医学院检验医学院09级医学检验本科二班，610500〕

【摘要】?目的用福州蓝图生物工程出品的乙肝外表抗原ELISA法定量分析试剂盒对乙肝外表抗原定量测定的方法进行验证，以判断是否能用于教学以及临床分析。方法运用ELLISA法定量测定乙肝外表抗原，应用试剂盒HBsAg标准从浓度为8ng/ml的2倍稀释的6个浓度梯度，根据OD值绘制标准曲线再计算相对回收率和板内和板间精密度，通过资料数据综合分析。结果HBsAg线性较好，其准确度、精密度、LOD值均在正常范内。结论ELISA法定量检测HBsAg能较准确、快速地反映体内乙肝病毒复制情况，可以用于教学以及临床分析。

【关键词】?乙肝外表抗原方法学验证标准曲线精密度ELLISA

病毒性肝炎中乙型肝炎的危害较大，我国是病毒性乙型肝炎的高发流行区，普通人群的乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染率接近60％，约占世界HBV携带者的1/3。乙型肝炎病毒的病原体不仅具有传染性，还可能导致开展成肝硬化，甚至肝癌，所以乙型肝炎病毒的早期、准确、定量检测对乙型肝炎临床诊断、疗效观察及预防具有重要的意义。酶免分析法HBV—EIA是HBV抗原和抗体最常用的检测技术，其方法简便、价廉，适合一般实验室推广，其中酶联免疫吸附技术(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)目前应用最为广泛，它常用聚苯乙烯为固相载体，使其与待测标本中的相应抗体或抗原结合，然后加酶标记的抗原或抗体，再加底物显色，最后根据色泽深浅来推算待测抗原或抗体的含量。此方法特异性高，有效测定范围可到达20500ng/ml，且酶免疫法有标记的试剂比拟稳定并且无放射线危害等优点。

我们采用对抗体浓度的样品进行ELISA的定量检测，通过对其数据的分析来验证ELISA法最乙肝外表抗原定量检测的准确性和可靠性，以衡量其实用性。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂盒

乙肝外表抗原ELISA法定量分析试剂盒，福州蓝图生物工程出品。1.1.2仪器及酶标板

酶标仪：Bio-Rad680；洗板机：Bio-Rad1575；超纯水系统：MilliporeElix；电热恒温培养箱(DNP-9052):上海精宏实验设备。

1.1.3溶液配制

=1\*GB2⑴0.01MpH7.4的PBS缓冲液：

称取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。

=2\*GB2⑵质控品：

用PBS缓冲液将标准品配制成6、3、1.5ng/ml三个质控品，每质控品1ml。首先取450μl的8ng/ml的标准品到C1号EP管中再向其中参加150μl的PBS缓冲液，即配制成了6ng/ml的质控品，再取300μlC1号EP管内的溶液到C2号EP管内，再向C2号管内参加300μl的缓冲液混匀。即配制成了3ng/ml的质控品。接着取300μlC2号管内的液体到C3号EP管内，再参加300μl的缓冲液混匀，即配制成了1.5ng/ml的质控品。具体方法如下列图1

C23

C2

3ng/ml

C1

C1

6ng/ml

C3

1.5ng/ml

图1

1.2检测方法

标准曲线各浓度的配制

=1\*GB2⑴用PBS缓冲液将标准品配制成8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml。

=2\*GB2⑵先取6个EP管分别标记为对应的浓度。

=3\*GB2⑶取400μl标准品于标记为?的EP管中，再取200μl?号管内液体于?号管内再向?号管中参加200μl的缓冲液混匀，即配制成了浓度为4ng/ml的标准品。

=4\*GB2⑷再从?号管内取200μl的液体到?号管内，接着取200μl的缓冲液到?号管内混匀，即配制成了2ng/ml的标准品。

=5\*GB2⑸从?号管内取200μl的标准品到④号管内，再向④号管内参加200μ