现代环境生物技术原理.pptVIP

5.3.1基因工程概述⑴基因工程的诞生 基因工程的诞生在理论上得益于三大发现：①Avevy(1934)等人的研究成果证明了遗传物质是DNA而不是蛋白质，从而解决了遗传信息的来源问题；②Watson-Crick(1953)的双螺旋结构学说阐明了信息载体DNA的复制并解决了信息传递的方式问题;③Monod和Jacob（1961）提出操纵子学说，Nireberg(1966)等破译了遗传密码，叙述了“中心法则”，解决了遗传信息流向和表达的问题。第62页，共121页，星期日，2025年，2月5日 基因工程的诞生在技术理论上得益于三大发明：①Smith、Wilcox（1970）和Boyer（1972）等发现了限制性核酸内切酶和Khorana(1970)等发现了DNA连接酶，使DNA分子的切割和连接成为可能，从而为基因工程的技术操作奠定了良好的基础；②Lederberg(1946)发现细菌的F-性因子，以后相继发现和建立了其它外源基因运载体，Cohen（1973）首次将质粒作为基因工程的运载体使用；③Baltimore和Temin(1970)等人发现了逆转录酶，打破了中心法则，使真核基因的制备成为可能。第63页，共121页，星期日，2025年，2月5日 具备了以上的理论与技术基础，基因工程诞生的条件已经成熟。1972年Berg(伯格)等人在世界上首次进行了DNA的体外重组，得到了包含SV40和λDNA的重组DNA分子。1973年Cohen(科恩)等人将编码卡那霉素的质粒DNA和编码四环素抗性的基因进行重组并转化大肠杆菌，结果转化菌同时表现出了卡那霉素和四环素的双重抗性，至此基因工程技术宣告诞生。随着分子生物学基础技术的发展，随后又出现了杂交技术、序列测定技术、PCR技术等一系列新技术，从而使基因工程技术日臻完善，第64页，共121页，星期日，2025年，2月5日⑵基因工程的定义基因工程（Geneticengineering)是将不同生物的基因在体外人工剪切组合并和载体（质粒、噬菌体、病毒）DNA连接，然后转入适当的宿主细胞中进行扩增，并使转入的基因在细胞内表达，产生所需要的蛋白质。第65页，共121页，星期日，2025年，2月5日目前基因工程的发展极为迅速，为生物学、医学、农学和环境科学等学科的理论研究及工业、农业和人类日常生活都带来了革命性的变化，其意义毫不逊色于有史以来任何一次技术革命，概括起来体现在以下三个方面：①用于大规模生产生物分子；②改造现有物种及设计构建新物种；③寻找、分离和鉴定生物体的遗传信息资源。第66页，共121页，星期日，2025年，2月5日⑶基因工程的主要内容一个完整的体外DNA重组过程主要包括以下步骤；①获取目的基因并进行必要的改造；②选择合适的载体并加以适当的修饰;③将目的基因与载体连接，获得含有目的基因的重组载体；④将重组载体导入相应细胞(称为宿主细胞)并筛选出合重组DNA的细胞第67页，共121页，星期日，2025年，2月5日 DNA重组流程示意图第68页，共121页，星期日，2025年，2月5日 获得含有重组载体的细胞后，通过大量培养重组细胞，可以获得目的基因的大量拷贝或目的基因的表达产物。通常将来自于同一始祖的一群相同分子、细菌、细胞或动物称为克隆，获取大量单一克隆的过程称为克隆化，也称无性繁殖。 广义的重组DNA技术不仅包括DNA体外重组技术及操作过程，还包括表达产物的后续处理过程和技术，如：蛋白质的分离纯化、第69页，共121页，星期日，2025年，2月5日5.3.2目的基因的获得 (1)从基因组DNA中分离此法适用于结构简单的原核生物中的多拷贝基因，可直接从组织或供体中用理化方法或合适的限制性内切酶将DNA消化后分离获得。第70页，共121页，星期日，2025年，2月5日 ①基因的随机断裂方法 采用一定的理化方法将基因组DNA随机断裂，可以得到大小基本一致的DNA片段。这些方法有用专一性核酸酶酶解，化学处理或普遍使用的机械切割法。DNA在溶液状态是呈细长线性分子，刚性强，在受到机械剪切作用时很容易断裂。用超声波处理DNA溶液，可得到平均长度在一定范围的DNA片段，使用组织捣碎，控制一定的条件，也可以使基因组DNA得到可控的剪切，如在1500rpm下，捣碎30min，可以得到平均大小为8kb的DNA片段。第71页，共121页，星期日，2025年，2月5日 ②限制性内切酶降解一般多采用“鸟枪法”，即限制性内切酶部分酶解法。限制性内切酶降解所产生的片段的长短与其识别序列的长短直接相关。理论上讲，一个识别几个碱基的限制酶位点在基因组的分布几率为1/4n(n为限制性内切酶所识别的特异序列中的核苷酸个数)，因此采用基因组DNA进行限制酶的