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2024年临床执业医师考试辅导讲义《生物化学》第十三章DNA重组技术

第十三章DNA重组技术

第一节DNA重组技术概述

DNA重组技术，又称基因工程，是指将不同来源的DNA分子进行体外切割、连接，然后导入宿主细胞内，使外源基因在宿主细胞中表达，从而获得特定基因产物或新的遗传性状的技术。它诞生于20世纪70年代，是现代生物技术的核心。其基本步骤包括目的基因的获取、基因载体的选择与构建、目的基因与载体的连接、重组DNA分子导入宿主细胞、重组体的筛选与鉴定以及目的基因的表达与调控。

第二节工具酶

在DNA重组技术中，工具酶起着关键作用。

1.限制性核酸内切酶：能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并在识别位点或其附近切割DNA双链。分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，其中Ⅱ型限制性核酸内切酶在基因工程中应用最为广泛。例如EcoRⅠ，它识别的序列是5’-GAATTC-3’，切割后产生黏性末端。

2.DNA连接酶：催化DNA片段之间的磷酸二酯键形成，将目的基因与载体连接起来。常用的是T4DNA连接酶，它可以连接黏性末端和平末端。

3.DNA聚合酶：如大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ及其大片段（Klenow片段），可用于DNA的合成、缺口填补等。

4.逆转录酶：以RNA为模板合成DNA，在获取真核生物目的基因时非常有用。

第三节基因载体

基因载体是携带目的基因进入宿主细胞的工具。

1.质粒：是细菌染色体外的环状双链DNA分子，具有自主复制能力。常用的质粒载体有pBR322、pUC系列等。质粒载体具有多个限制酶切点、筛选标记（如抗生素抗性基因）等特点。

2.噬菌体：如λ噬菌体，经过改造后可作为基因载体。它可以容纳较大的外源DNA片段，感染细菌的效率高。

3.病毒载体：如腺病毒载体、逆转录病毒载体等，可用于将目的基因导入真核细胞，在基因治疗中应用广泛。

第四节目的基因的获取

1.基因组DNA文库：将生物体的全部基因组DNA用限制性核酸内切酶切割成一定大小的片段，与载体连接后导入宿主细胞，构建成包含生物体全部基因的文库。

2.cDNA文库：以mRNA为模板，利用逆转录酶合成cDNA，再与载体连接导入宿主细胞，构建的文库只包含表达的基因。

3.PCR技术：即聚合酶链反应，通过设计特异性引物，在体外快速扩增目的基因。它具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。

4.化学合成法：如果已知目的基因的核苷酸序列，可通过化学方法合成目的基因。

第五节重组DNA分子的构建与导入

1.重组DNA分子的构建：选择合适的限制酶切割目的基因和载体，然后用DNA连接酶将它们连接起来，形成重组DNA分子。

2.重组DNA分子的导入

-转化：将重组质粒导入细菌等原核细胞的过程。常用的方法有CaCl?法，使细菌处于感受态，易于吸收外源DNA。

-转染：将重组DNA分子导入真核细胞的过程。常用的方法有磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法等。

-感染：利用噬菌体或病毒载体将重组DNA分子导入宿主细胞。

第六节重组体的筛选与鉴定

1.遗传学方法：根据载体上的筛选标记进行筛选，如抗生素抗性筛选。将转化后的细胞接种在含有相应抗生素的培养基上，只有含有重组质粒的细胞才能生长。

2.核酸杂交法：用标记的核酸探针与重组体中的DNA进行杂交，检测目的基因的存在。常用的方法有Southern印迹杂交、Northern印迹杂交等。

3.PCR法：设计特异性引物，对重组体进行PCR扩增，检测目的基因。

4.测序法：对重组体中的目的基因进行测序，确定其核苷酸序列的正确性。

第七节目的基因的表达与调控

1.原核表达系统：常用的是大肠杆菌表达系统。优点是培养简单、生长快、成本低。但原核细胞缺乏真核细胞的蛋白质加工和修饰能力。

2.真核表达系统：如酵母表达系统、哺乳动物细胞表达系统等。真核表达系统可以对蛋白质进行正确的加工和修饰，表达的蛋白质具有天然的生物学活性。

试题

1.下列哪种酶是DNA重组技术中常用的限制性核酸内切酶？

A.DNA聚合酶

B.逆转录酶

C.EcoRⅠ

D.T4DNA连接酶

答案：C。EcoRⅠ是常用的限制性核酸内切酶，DNA聚合酶用于DNA合成，逆转录酶用于以RNA合成DNA，T4DNA连接酶用于连接DNA片段。

2.基因工程中常用的质粒载体不具有以下哪个特点？

A.多个限制酶切点

B.自主复制能力

C.只能容纳小片段DNA

D.筛选标记

答案：C。质粒载体可容纳一定大小的外源DNA片段，并非只能容纳小片段DNA，它具有多个限制酶切点、自主复制能力和筛选标记等特点。

3.构建cDNA文库时，需要用到的酶是？

A.限制性核酸内切酶

B.逆转录酶

C.DNA连接酶

D.以上都是

答案