区室化工程改造解脂耶氏酵母提高合成红没药烯能力的研究.pdfVIP

摘要

αβγ-

红没药烯是一种疏水单环倍半萜，具有三种结构异构体，即、、红没药烯。

红没药烯是植物的次生代谢产物，由于其令人愉悦的果香和香脂香气，通常被用作食

品和化妆品的香料；在制药工业中可作为抗炎和抗癌剂；此外，因为其含有较高的能

量和与化石燃料相似的物理化学性质，已经被能源部门确定为可替代生物柴油的新一

代能源物质。因此，红没药烯的市场需求越来越大。

解脂耶氏酵母属于非常规酵母，已经被美国食品和药物管理局公认为安全（GRAS）

的微生物。与常规微生物底盘相比，解脂耶氏酵母可以利用的底物类型（如糖类、醇

类、烷烃、油脂类等）更为丰富，再加上其天然具有甲羟戊酸途径和充足的乙酰辅酶

A、NADPH和ATP供应，因此被认为是生产红没药烯等植物天然产物的极具潜力的

微生物底盘细胞。

在本实验室之前的研究中，利用厨房废油作为碳源在解脂耶氏酵母线粒体中实现

了红没药烯的合成，与细胞质工程菌株相比，产物产量明显提高，这也证明了亚细胞

区室化策略是非常有效的提产策略。因此在本研究中，拟通过将红没药烯生物合成途

径和过氧化物酶体中的β-氧化途径直接偶联，实现产物产量提高的同时探索过氧化物

酶体区室化工程策略在提高解脂耶氏酵母生产红没药烯产量方面的潜力。同时，本研

究拟将多种代谢工程策略包括区室化工程、转运蛋白工程、途径工程、动态调控工程

等进行组合使用，尝试解决过去仅仅通过对主合成途径基因进行强化表达无法获得满

意结果的问题，最终实现目标产物在过氧化物酶体这一亚细胞工厂中的高效合成。

本研究，首先利用区室化定位技术将解脂耶氏酵母内源的法尼烯基合成途径和异

源α-红没药烯合成酶定位到解脂耶氏酵母过氧化物酶体中，得到的工程菌株Po1gP1

在以葡萄糖底物的培养基中获得了140.3mg/L的α-红没药烯，在以厨房废油为底物的

460.8mg/Lα-Po1gKαBS

培养基中获得了的红没药烯，分别相较于对照菌株（从以葡

萄糖底物的培养基中获得0.4mg/L的α-红没药烯）提高了349%和1149%。在完成α-

红没药烯生物合成途径亚细胞区室化的基础上，采用系统代谢工程策略包括利用转运

蛋白增强红没药烯输出能力，减小对细胞的毒害性、优化内源限速基因和异源基因的

拷贝数，突破了代谢瓶颈，将红没药烯产量提升到了1.7g/L；控制共同前体乙酰辅酶

A在内源性脂质和异源α-红没药烯合成之间的平衡、改善ATP和乙酰辅酶A的供应，

2.6g/Lα-

使红没药烯的产量达到了；通过动态调控过氧化物酶体使红没药烯合成量大

幅提升到了3.0g/L。最终，所构建的工程菌株PolgP12利用厨房废油作为碳源，在生

物反应器中通过分批补料的方式获得了15.5g/L的α-红没药烯，这是迄今为止所报道

的工程微生物亚细胞工厂菌株中的最高产量。

综上所述，本研究通过过氧化物酶体区室化工程及系统代谢工程策略实现了α-红

没药烯在解脂耶氏酵母中高效可持续合成，充分挖掘了解脂耶氏酵母合成α-红没药烯

的潜力，为今后开展解脂耶氏酵母等微生物亚细胞工厂合成红没药烯或其他高附加值

萜类化合物提供了有价值的参考。

关键词：解脂耶氏酵母；红没药烯；过氧化物酶体；系统代谢工程；厨房废油

ABSTRACT

Bisaboleneisahydrophobicmonocyclicsesquiterpene,hasthreestructuralisomers,

namelyα,β,andγ-bisabolene.Itisasecondarymetaboliteofplantsandiscommonlyused

asafragranceinfoodandcosmeticsduetoitspleasantfruityandbalsamicaroma;asan

anti-inflammatory