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分子杂交技术与应用

分子杂交技术的目的是什么？分子杂交的基本方法有哪些？Southern印迹法有哪些步骤，为了达到什么目的呢为什么叫印迹法呢？

酸碱热变性剂（尿素）有机溶剂（乙醇）????????????????????????????????????????????????????????????????????????

变性后核酸的特点：粘度下降密度增加紫外吸收增加

杂交A定义

两条来源不同，但具有互补序列的核酸，按碱基配对原则复性形成一个杂交体，这个过程即分子杂交。DNA/DNA的杂交作用：检测特定生物有机体之间的亲源关系DND/DNA或RNA/DNA：揭示核酸片断中某种特定基因的位置。B

1975，Southern印迹杂交法:DNA010102031977，Northern印迹杂交法：RNA1979，Western印迹杂交法：Protein0203

由Southern1975年设计。被检测对象为DNA。01Southern印迹杂交02

具体研究什么呢？克隆基因DNA的酶切图谱分析【哪里可以剪开】基因组中某一基因的定性与定量分析【有没有这个基因；在哪里】基因点突变【在哪个地方出现突变】限制性片段长度【可以被剪开的片段多长】

带有DNA片段的凝胶DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳至膜（尼龙膜或硝酸纤维素滤膜）上转膜杂交、显影凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印迹杂交的技术流程

（一）待测核酸样品的制备01提取待测DNA02用限制酶将DNA切成大小不同的片段03用EDTA，65℃灭活限制酶，进入下一步骤——电泳分离片段。

（二）电泳分离DNA片段3241目的：确定杂交靶分子的大小【待测片段】胶的注意事项有四条，一起来看书：原则：分辨大片段用低浓度胶；分辨小片段用高浓度胶如何确定片段大小：用marker【标准分子量DNA】

（三）印迹转移前凝胶的预处理分子量不同所需转移的时间不同；01浸泡在0.25M的HCL溶液中脱嘌呤02再进行碱变性，待测DNA链断裂单链，以便与已知序列的DNA杂交03

（四）转膜（印迹）谁转移？将凝胶中已成单链的待测DNA片段转移到哪里？膜：固相支持物，常用NC膜和Nylon膜转移后有什么特点？转到膜上的相对位置跟在凝胶中的一样

（a）（b）（c）（d）（e）基因组DNADNA限制片段硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基因DNA片段X光底片

白瓷盘玻璃板滤纸凝胶尼龙膜滤纸吸水纸玻璃板重物吸水纸转膜

硝酸纤维素（NC）膜不能滞留小于150bp的DNA片断，不能同RNA结合。RNA变性后也能十分容易的结合到膜上尼龙膜：耐用，结合力强，但其本底高。本底：指没有进样时检测到的信号值.

尼龙膜或硝酸纤维素膜杂交的步骤：01印迹杂交：将具有核酸印迹的滤膜和带标记的DNA/RNA进行杂交。03核酸印迹转移：将核酸样品转移到固体支持膜上。利用的是毛细管作用02

（五）、核酸探针STEP03STEP01STEP02探针（probe）的概念指能与特定靶分子发生特异性相互作用，并能被特殊方法所检测的分子。例如抗原-抗体等均可看成是探针与靶分子的相互作用。

基因探针

指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记（同位素或非同位素标记）的核苷酸链。

基因组DNA探针2.探针种类01以mRNA为模板经逆转录产生的DNA链。RNA探针03为某一基因的全部或部分序列。cDNA探针02以DNA两条链中的任意一条为模板转录生成RNA。寡核苷酸探针04

探针的选择

高度特异性，一般探针越长，杂交作用越强，其专一性也越强。

01标记物稳定灵敏，检测方便安全标记物（32p,35S,125I,地高辛（DIG）,FITC）单链核酸（ssDNA）高特异性（~500bp）020304探针基本条件（特点）

（1）、标记物

放射性同位素标记物

非放射同位素标记物

探针标记物放射性标记物：32p(14d)、35S(87d)、3H(12y)、125I(60d)非放射性标记物：半抗原：生物素、地高辛荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC）

a、放射性标记物01特点：02可用放射自显影技术检测，信号的强弱易于进行定量分析。03主要缺点04射线对人体有伤害05放射性物质需特殊的处理06半衰期短不宜存放使用07

B、非放射性标记物

常用的有地高辛（digoxigenin，Dig）、生物素（biotin）、荧光素。

特点：

敏感性不如同位素标记

稳定性和分辨率高

检测时间短

操作简便

不需特殊的防护设备

不存在放射性污染

（六）核酸的固定01烘烤80℃2小时02紫外光固定03碱