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第五章工业微生物育种诱变剂本章内容：化学诱变剂物理诱变剂生物诱变剂

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碱基类似物是如何提高突变频率的?6在DNA复制过程中取代正常碱基，整合进DNA分子01它们产生异构体的频率高，出现碱基错配的概率也高02

（一）碱基类似物的诱变机制5-溴尿嘧啶（5-BU）的结构——现以5-BU为例来分析碱基类似物的诱变机制。当胸腺嘧啶分子结构中5位碳原子上的甲基被溴（Br）原子取代，就构成了5-BU的结构式。

5-溴尿嘧啶（5-BU）的碱基配对

5-BU掺入错误10G≡CG≡BUeG≡CG≡BUeG≡CA=TA=BUkA:TA:BUkA:TG≡BUeA:TG≡CG≡BUeG≡C→A=TA:T→G≡C

由于5-BU的诱变作用是在DNA复制过程中实现的，因此，处在静止或休眠状态的细胞是不适合的。细菌采用对数期的细菌，霉菌、放线菌采用孢子，但要进行前培养，使孢子处于萌动状态，并要加大5-BU的浓度，处理过程要进行振荡培养。

（二）碱基类似物的诱变处理方法（以5-BU为例）5-BU是白色结晶粉末，能溶于水或乙醇。诱变处理方法如下：1.单独处理新鲜斜面的细菌——转接到前培养的液体培养基中——培养到对数期——离心除去培养液——加入生理盐水或缓冲液——饥饿培养8—10小时——加入5-BU到培养液中，使最后的处理浓度为25—40μg/ml,混合均匀——取0.1—0.2ml菌悬液加入到琼脂平板上涂布培养——在适宜温度下，使之在生长过程中诱变处理——培养后挑取单菌落，进行筛选。

真菌、放线菌孢子，则要提高5-BU的浓度（0.1—1mg/ml），加到孢子悬液后，进行振荡培养数小时(一般6—12h)——分离于平皿——适温培养——挑取单菌落，进行筛选。据报道，如果菌体先用5-BU等碱基类似物进行处理，使它们首先渗入到DNA分子中，然后用辐射线照射，诱变效果会比单独使用辐射线更好。因此，碱基类似物也是一种辐射诱变的增敏剂。2.与辐射线复合处理

亚硝酸（b）羟胺（c）甲基磺酸乙酯（d）N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍

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亚硝酸的脱氨基作用及其诱发的突变

A:TG┆C19

亚硝酸的处理方法试剂的配制（1）1mol/LpH4.5醋酸缓冲液（2）0.1mol/L亚硝酸钠溶液（3）0.07mol/LpH8.6磷酸氢二钠溶液2.处理方法（以处理浓度0.025mol/L为例）取孢子悬液1ml，pH4.5醋酸缓冲液2ml及0.1mol/L亚硝酸钠溶液1ml，最后处理浓度为0.025mol/L。于25—26℃保温10—20min，加入0.07mol/L、pH8.6的磷酸氢二钠溶液20ml，使pH下降至6.8左右，以终止反应。稀释分离于平板。

注：在亚硝酸处理菌体或孢子时要严格控制好温度，否则会影响诱变效果。如果是处理细菌，亚硝酸最后浓度以0.05mol/L为例：将斜面新鲜菌体移入肉汤培养基，适温培养到对数期，将培养液进行离心，弃去上清液，用生理盐水洗涤。pH4.5醋酸缓冲液和0.1mol/L硝酸钠溶液1:1浓度加入沉淀的菌体中，使之悬浮。于35—37℃处理5—10min、加入5倍的pH8.6的磷酸氢二钠溶液，使pH下降到6.8。取一定量进行后培养1.5—2h。然后稀释分离于平板上。

羟胺的诱变机制改变了结构的胞嘧啶

根据诱变机制，羟胺不能使突变回复，即不能使A:TG:C转换，进行逆向突变。01由于羟胺是诱发G:CA:T的专一性诱变剂，因此，可以用来鉴别突变体是A:TG:C还是G:CA:T转换。02羟胺的处理方法：常用浓度为0.1—5%，可直接在溶液中处理，时间1—2h，然后分离培养。但一般都加到琼脂平板或振荡培养基中，然后接入孢子或细菌，在适温下培养，生长过程中处理，所用浓度比直接处理时低些。03

——烷化剂是诱发突变中一类相当有效的化学诱变剂，这类诱变剂具有一个或多个活性烷基，它们易取代DNA分子中活泼的氢原子，直接与一个或多个碱基起烷化反应，从而改变DNA分子结构，引起突变。双功能烷化剂单功能烷化剂多功能烷化剂根据烷化剂中活性烷基的数目亚硝基类、磺酸酯类、硫酸酯类、重氮烷类、乙烯亚胺类化合物硫芥子、氮芥子类等

部分烷化剂和烷化碱基26烷化碱基部分烷化剂甲基磺酸甲酯亚硝基乙基脲7-甲基鸟嘌呤3-甲基腺嘌呤O6-甲基鸟嘌呤

烷化剂的诱变机制——烷化剂主要使通过烷化基团使DNA分子上的碱基及磷酸部分烷化，DNA复制时导致碱基配对错误而引起突变。碱基中容易发生烷化作用的是嘌呤类。其中鸟嘌呤N7是最易起反应的位点，几乎可以和所有烷化剂起烷化作用；甲基磺酸乙酯主要使嘌呤N7烷基化。