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ICS11.220CCSB41
团体标准
T/CVMA269—2025
鸡球虫虫种的PCR鉴定技术
PCRidentificationtechniqueofchickencoccidiaspecies
2025-7-10发布2025-7-10实施
中国兽医协会发布
T/CVMA269—2025
I
前言
本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中国兽医协会兽医寄生虫病防治分会提出。
本文件由中国兽医协会归口。
本文件起草单位：南京农业大学、江苏省农业科学院、江苏农牧科技职业学院、中农华威制药股份有限公司。
本文件主要起草人：宋小凯、李祥瑞、徐立新、严若峰、陆明敏、黄欣梅、刘剑华、蒲响林、莘仕林，游锡火、曾徐浩、何钦义。
T/CVMA269—2025
1
鸡球虫虫种的PCR鉴定技术
1范围
本文件规定了鉴定公认的7种鸡球虫虫种的PCR鉴定技术。
本文件适用于公认的7种鸡球虫的鉴定，包括柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫和早熟艾美耳球虫。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
鸡球虫chickencoccidia
一种专性细胞内寄生原虫，寄生于鸡的肠上皮细胞内，主要危害3个月以内的雏鸡，15~50日龄时更为严重，除造成死亡外，病愈鸡长期不能康复。卵囊呈圆形、卵圆形或椭圆形。鸡球虫在分类学上属于原生动物门（Protozoa）、顶复器门（Apicomlexa）、孢子虫纲（Sporozoasida）、球虫亚纲（Coccidiasina）、真球虫目（Eucoccidiorida）、艾美耳亚目（Eimeriorina）、艾美耳科（Eimeriidae）和艾美耳属（Eimeria）。公认的鸡球虫有7种，分别为柔嫩艾美耳球虫（Eimeriatenella）、毒害艾美耳球虫（Eimerianecatrix）、堆型艾美耳球虫（Eimeriaacervulina）、布氏艾美耳球虫（Eimeriabrunetti）、巨型艾美耳球虫（Eimeriamaxima）、和缓艾美耳球虫（Eimeriamitis）和早熟艾美耳球虫（Eimeriapraecox），其孢子化卵囊的形态如附录A图A.1所示。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
bp：碱基对（basepair）
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）
ITS：内转录间隔区（internaltranscribedspacer）
PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）
PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebufferedsaline）
TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸（tris-acetate-EDTA）
T/CVMA269—2025
2
5仪器设备和主要试剂
5.1仪器
PCR仪、4℃高速低温离心机、台式低速离心机、电泳仪、微量移液器、凝胶成像系统。
5.2主要试剂和材料
DL500DNAMarker、2×TaqDNA聚合酶Mix、琼脂糖、1×TAE缓冲液、上样缓冲液、PBS、去离子水、SDS裂解液、酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）DNA提取液、异丙醇、75%无水乙醇、7种鸡球虫卵囊，其中1×TAE缓冲液和PBS等试剂的配制符合GB/T6682-2008第4.3条的规定。
6操作步骤
6.1卵囊的洗涤
取保存于2.5%重铬酸钾液的待检鸡球虫卵囊至15mL离心管中，补加PBS至10mL，3000r/min离心8min，弃上清，重复以上操作3次，显微镜下计数。
6.2卵囊DNA的提取
按以下步骤提取鸡球虫基因组DNA：
a)取经洗涤后的卵囊2000个至2mL离心管，加入600μLSDS裂解液和200mg直径为0.4~0.6mm玻璃珠，涡旋仪剧烈振荡10min，12
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