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1第六章基因克隆的技术路线
2基因工程（上游）大体步骤单击此处添加正文。连接产物导入细胞单击此处添加正文。目的基因与载体连接各种质粒各种病毒皆经改造获取目的基因单击此处添加正文。目的基因表达逆转录PCR法PCR法直接调用法原核细胞真核细胞哺乳动物细胞植物细胞
3第一节
获得目的基因
4直接分离目的DNA经限制酶切割，电泳分离DNA片断。 适用于获得细菌、质粒、病毒等低等生物的基因片段。真核生物的染色体DNA中含有内含子序列，不适合于基因工程的需要。
52.cDNA文库ThecDNAlibrary:containsonlycomplementary DNAmoleculessynthesizedfrommRNA moleculesinacell.以mRNA为模板，逆转录合成的互补DNA。以此得到的某种细胞内所有mRNA的cDNA，称为cDNA文库。
63.RT-PCR基本原理：将细胞中mRNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板，进行PCR反应。mRNAcDNAPCR产物
7第二节重组DNA分子的构建
8一.目的基因与载体的连接粘末端连接Linkofcohesiveend
9平末端连接Linkofbluntend
10平末端连接添加标题RecombinantDNA01添加标题T4DNAligase02添加标题vector03添加标题104
11010203040506平末端连接的缺点单击此处添加小标题self-reconnection自身环化单击此处添加小标题moredifficultligation连接困难单击此处添加小标题noeasywayofretrieving theinsert单击此处添加小标题2-directioninsertion双向插入单击此处添加小标题重新筛选插入的片断困难单击此处添加小标题
12vector12vector12AABAB平齐末端连接时，插入的方向是随机的，称为双向插入。会给后续的工作造成很多麻烦。
13单酶切粘末端连接EcoRI01EcoRI02
14单酶切粘末端连接的特点优点*Usingthesameoneenzymetocut用同一种酶切Ligatedeasilyandcoveniently连接容易方便缺点*Self-reconnectionofvector载体自身环化Insertedintwodirections双向插入
15单酶切粘末端的双向插入GCTTAAGCTTAA叁GCTTAAAATTCG贰AATTCGGCTTAA壹AATTCGAATTCG
16
17AATTCxxxxxxAGxxxxxxTTCGAGAGCTTCTTAAAGAATTCxxxxxxAAGCTTCTTAAGxxxxxxTTCGAAligase双酶切粘末端连接EcoRIHindIIIEcoRIHindIII
18双酶切粘末端连接的特点Usingthesametwoenzymestocut01noself-reconnectionofvector03缺点操作比较麻烦。如果两种酶要求的条件不同，需要进行两个阶段的反应。05Ligatedeasilyandconveniently02Insertedinonedirection定向插入04
19几种实验方法利用相应的技术方法，使实验顺利进行。
20Linkofhomopolymerictails末端转移酶添加同聚尾避免质粒的自身环化
21添加接头，引入限制酶的切割位点，然后用相应的酶切割。
22第三节重组子导入细胞野生型细菌具有针对外源DNA的限制和修饰系统，会切割外源DNA分子。因此用于基因工程的受体菌，需经筛选和人工改造。
23外源DNA转入细胞的过程叫做转化。但不包括由病毒介导的DNA转入。常用的方法有两种：
24氯化钙法：利用氯化钙和热休克使受体菌成为感受态细胞，促进外源DNA的进入。ThefirstisachemicalmethodutilizingCaCl2andheatshocktopromoteDNAentryintocells.
25宿主细胞与重组DNA在00C的氯化钙溶液中孵育，快速转入420C造成热休克。经此处理后的细胞“容易”接受外源的DNA，一般叫做感受态细胞。
26处理宿主细胞低渗溶液＋热休克E.coli+0.1MC
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