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分子生物学与临床天津市第三中心医院刘树业

PCR技术在临床实验室应用的价值随着分子生物学技术的发展，聚合酶链反应（PCR）技术已逐渐应用于遗传性疾病、肿瘤及感染性疾病等方面的诊断。.检测临床标本中病原体核酸序列。.肿瘤基因突变情况。.遗传性疾病的基因序列。.人类白细胞表面抗原（HLA）配型。.法医学方面的鉴定工作。

优点：灵敏度高，理论上，只要标本中含有一个分子的DNA或RNA就可以作出诊断。特异性强，对于一个19核苷酸的引物来说，非特异性配对的概率为419=2.75*1011这表示要与这19个碱基的排列顺序完全相同时需要的基因组DNA片段的最小长度，而人的基因组长度为3*109碱基对，以克服血清学诊断有交叉反应的缺陷。可以早期诊断，如在HCV的感染中，第一周内就可以检测出HCVRNA，而抗体的产生一般在第二周以后。PCR在诊断病原体感染时的优缺点

对于体液免疫力低下或使用免疫抑制剂而无抗体产生者，PCR却可以作出明确诊断。01可以对病原体作定量分析，反映病原体在机体的复制及动力学变化情况。02可对病原体进行基因分型。指导临床治疗。03

不足之处:操作复杂，技术不易被熟练掌握。价格昂贵。出于敏感性太高，操作步骤多而复杂，即使有极少量的污染也会造成假阳性。由于操作复杂，对试剂及实验条件要求严格，稍有差错就会出现假阴性。12

今后仪器和试剂的发展方向：封管、定量及自动化；1样品采集方式对PCR很重要，比操作更重要。2内标作用：操作过程的监控、控制假阴性。3从核酸提取、扩增到检测，对照与待测标本同步进行；4几点认识

禁用产物的电泳分析技术。01探针杂交技术和防污染技术的采用是一大进步。02

常用于基因扩增检测的临床标本包括EDTA或枸橼酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。采血液等样本时，应使用一次性密闭容器，如真空采血管。当使用非密闭采样系统时，如尿、分泌物和骨髓的采样，必须注意防止来自采样者皮屑或分泌物的污染。采样时必须戴一次性手套。玻璃器皿在使用前应高压处理，因为玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。最好是热灭菌，250℃烘烤4小时以上可使RNA酶永久性失活。全血和骨髓标本必须进行抗凝处理。EDTA和枸橼酸盐是首选的抗凝剂。不能使用肝素抗凝，因为肝素是Taq酶的强抑制剂，而且在其后的核酸提取步骤中很难去除。临床用于RNA（如HCVRNA）扩增检测的血标本建议进行抗凝处理，并尽快（3小时以内）分离血浆，以避免RNA的降解。如未作抗凝处理，则抽血后，必须在1小时内分离血清。一.标本的采集

用于DNA扩增检测的标本，采集后一般不需特殊的稳定化处理，但标本应及时送至实验室。由于RNA易受RNA酶的降解，因此用于RNA测定的标本有时必须进行稳定化处理，如流行病学调查的现场采样。异硫氰酸胍盐（Guanidinethiocyanate,GITC）可使DNA酶和RNA酶立即失活，因此在采集标本时，可将标本材料如血清或血浆按1∶4的比例加至含有5mol/LGITC的试管内中，从而使血清（浆）中的RNA酶不可逆失活。经上述稳定化处理后，标本一般不需要冷藏即可邮寄。对于特定的检测项目，上述稳定化处理方法的效果究竟如何，要使用相应的逆转录PCR测定方法来评价。二.标本的稳定化处理

三.标本的运送

四.标本的贮存

标本处理即核酸提取纯化是决定扩增检测成败的关键性步骤，在使用商品核酸提取试剂提取临床标本中的核酸模板前，应对其进行充分评价以验证其提取的有效性。通常，核酸制备质量不高是由于抑制物去除不完全所致，抑制物可能来源于标本本身（如血红素及其前体或降解产物）或核酸提取过程中残留的有机溶剂（如酚、氯仿等），这些物质对其后的Taq酶扩增反应步骤具有强烈的抑制作用，从而影响靶核酸的扩增测定。当标本为痰时，则必须先进行液化处理，再提取核酸。需注意的是，液化时不能加热，液化时间不能过长。此外，当靶核酸为RNA时，逆转录PCR测定失败的常见原因是标本在运送前未经充分的稳定化处理(血清或血浆按1∶4的比例加至含有5mol/LGITC的试管内中，从而使血清（浆）中的RNA酶不可逆失活)及核酸提取试剂的RNA酶的污染。对于前者，要核查测定分析前的步骤，如果发现有RNA降解的证据，实验室则应拒绝接受标本，要求重新采取标本，并对运送者给以详细的指导。对于后者，建议使用高质量的商品核酸提取试剂。0102五.标本的处理（核酸提取）

类风湿因子01补体02嗜异性抗体03嗜靶抗原的自身抗体04医源性诱导的抗鼠Ig(s)抗体05交叉反应物质06标本中其它成分的影响07一.内源性物质(影响因子）

标本溶血01标本受细菌污染02标本保存不当03标本凝集不全04标本管中添加物质的影响05二.外源性物质

PCR测定的临床应用及

测定结果的临床意义结核