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蔗糖酶米氏常数的测定
【目的】：了解底物浓度与酶反应速度间的关系，学习求蔗糖酶米氏常数的方法
【原理】：米氏方程式v=
米氏常数的求法很多，最常用的是Lineweaver—Burk的作图法(双倒数作图法)。
米氏方程式可改写为下列倒数形式：
选择不同的[s]，测定相应的v，求出两者的倒数，以1/[s]为横坐标，以1/v为纵坐标作图，绘出一条直线，外推至横轴相交，横轴截距即为-1/Km。
Vmax[S]
Km+[S]
还原糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂反应：
仪器：分光光度计、恒温水浴、试管、吸管、秒表、坐标纸
试剂
【仪器与试剂】
01
3%蔗糖溶液（87.7mM）
mol/LNaAc缓冲溶液（pH4.6）
mol/LNaOH溶液
3,5-二硝基水杨酸试剂
标准葡萄糖溶液（1mg/mL）
02
【操作步骤】
1．葡萄糖标准曲线的制定
管号
0
1
2
3
4
5
葡萄糖标准液(mL)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水(mL)
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
3,5-二硝基水杨酸试剂(mL)
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
将各管溶液混合均匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即用冷水冷却至室温，以蒸馏水稀释至25mL，摇匀。测540nm处A值。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，A值为纵坐标作出标准曲线。
01
02
03
04
取试管8支编号，按下表将蔗糖溶液，醋酸缓冲液分别加入试管，于37℃水浴中保温10min。一定量酶液同一水浴中保温约10min。
按同样次序和时间间隔，加入1mL0.5mol/LNaOH，摇匀，终止反应。
于各管中依次按同样间隔(0.5min)加入已保温过的酶液1.0mL，计时，立即摇匀，在37℃中准确温浴5min。
吸取反应物1.0mL，加入盛有3.0mL3，5-二硝基水杨酸试剂和1.0mL水的试管中混匀，放入沸水浴中加热5min，冷却后稀释至25mL，摇匀，在540nm比色测定A值。
05
以A值对应的葡萄糖量为相对反应速度，以1/[S]为横坐标，1/v为纵坐标作图，由图求出Km值。
2．底物浓度和初速度υ测定
反应物
终止反应
活力测定
数据处理
管
号
3%
蔗糖液
(mL)
醋酸缓
冲液(mL)
酶液
(mL)
1mol／L
NaOH
(mL)
吸取反
应物
(mL)
水杨酸
试剂
(mL)
水
(mL)
A540
υ
底物浓度
1/[s]
1/υ
1
2
3
4
5
6
7
8
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.75
5.0
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
25
0
1.0
1.0
1.0
1.0
0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
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