第四章固定化酶.pptVIP

DEAE-Sephadex固定化氨基酰化酶：将DEAE-SephadexA25充分溶胀，用0．5mol/LNa0H和水洗涤后，加入pH7.0—7.5的米曲霉3042粗酶液(水解乙酰—DL-Ala活力为25umol/m1·h)充分混合(1g湿重载体加60ml酶液)后，于低温下搅拌过夜后，吸去上清液，再用蒸馏水和0.15mol/L醋酸钠水溶液洗涤固定化酶，置4℃备用。固定化酶活力回收50-60％，水解乙酰—DL—A1a活力为600-800umol/g·h湿固定化酶。氨基酰化酶也可固定于DEAE—纤维素。此外，DEAE—纤维素吸附的α—淀粉酶、蔗糖酶已作为商品固定化酶。第62页，共93页，星期日，2025年，2月5日通过酶蛋白化学修饰来增加蛋白质分子上电荷，能有效的克服吸附法制备的固定化酶在使用过程的解吸。用水溶性乙烯—顺丁烯二酸酐共聚物共价修饰的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶、可以用DEAE—纤维素和DEAE—Sephadex载体有效的固定。这种固定几乎是不可逆的吸附。此外，酶的吸附与解吸还与介质中离子强度、pH、温度、蛋白质浓度及酶和载体的特性相关。pH的变化影响到载体和酶的电荷，从而影响载体对酶的吸附。在等电点两侧(±1-2pH单位)吸附将明显减少，但也有个别例外。盐对吸附的影响较为复杂．在一些特殊事例中、盐可以促进蛋白质的吸附。这就是所谓的盐析吸附。对蛋白质吸附来说，随温度的升高吸附下降。载体的表面积、多孔性及其顶处理都影响对酶的吸附。第63页，共93页，星期日，2025年，2月5日热处理法将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体。热处理法只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化，在加热处理时，要严格控制好加热温度和时问，以免引起酶的变性失活。例如，将培养好的含葡萄糖异构酶的链霉菌细胞在60-65℃的温度下处理l5min，葡萄糖异构酶全部固定在菌体内。热处理法也可与文联法或其他固定化法联合使用，进行双重固定化。第64页，共93页，星期日，2025年，2月5日酶和细胞固定化方法酶和细胞固定化方法载体结合法交联法包埋法网格型微囊型物理吸附法离子结合法共价结合法热处理（细胞）第65页，共93页，星期日，2025年，2月5日三、酶的定向固定化酶固定化的一个主要缺点是固定化酶的活性通常会大幅度下降，其原因是它的活性位点可能会因为固定化酶的位阻障碍而妨碍底物进入到酶的活性位点；另外还会发生酶和载体产生多点的结合从而使酶失活。第66页，共93页，星期日，2025年，2月5日要使载体与酶形成共价键，必须首先使载体活化，即借助于某种方法，在载体上引进某一活泼基团。然后此活泼基团再与酶分子上的某一基团反应，形成共价键。第30页，共93页，星期日，2025年，2月5日固定化酶的制法是：利用酶所带的官能团（－NH2，－COOH，－SH，咪唑基，苯酚基等）与高分子化合物的官能团进行反应制得，例如将含－C6H4NCS的聚丙烯酰胺的官能团－C6H4NCS与含－NH2的酶中的官能团－NH2作用，可得以下固定化酶：第31页，共93页，星期日，2025年，2月5日使载体活化的方法很多。主要的有重氮法、迭氮法、溴化氰法和烷化法等。现分述如下：

①重氮法将含有苯氨基的不溶性载体与亚硝酸反应，生成重氮盐衍生物，使载体引进了活泼的重氮基团，此衍生物与酶蛋白分子中酪氨酸的酚基或组氨酸的咪唑基发生偶联反应，而成固定化酶。第32页，共93页，星期日，2025年，2月5日第33页，共93页，星期日，2025年，2月5日重氮法是将带芳香族氨基的载体，先用NaNO2和稀盐酸酸处理成重氮盐衍生物，再在中性偏碱(pH8—9)条件下与酶蛋白发生偶联反应，得到固定化酶。第34页，共93页，星期日，2025年，2月5日可能与酶蛋白中Tyr的酚基，His的咪唑基生成重氮衍生物，在过量重氮盐存在下还可与酶蛋白的N—端氨基或Lys的ε氨基形成双偶氮化合物。第35页，共93页，星期日，2025年，2月5日②叠氮法第36页，共93页，星期日，2025年，2月5日带有羧基或羟基、羧甲基等的载体，首先在酸性条件下用甲醇处理使之酯化，再