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产丁二酸大肠杆菌的代谢工程与发酵调控：策略、实践与展望

一、引言

1.1研究背景与意义

丁二酸，又名琥珀酸，作为一种重要的C4平台化合物，在诸多领域都有着广泛应用。在化工领域，丁二酸是合成涂料、塑料、树脂等产品的关键原材料，如聚丁二酸丁二醇酯（PBS）这种生物可降解塑料，就是以丁二酸和1,4-丁二醇为原料合成，PBS因具备良好的力学性能和合理的价格，在包装、农业地膜等领域有着广阔的应用前景。在医药领域，丁二酸可用于生产口服药物，还能优化抗生素结构，作为左旋霉素合成添加剂。在食品领域，丁二酸可作为食品酸味剂、增稠剂以及防腐剂和酸度调节剂，既能延长食品保质期，又能改善口感。此外，在日化领域，丁二酸及其衍生物可用于制备个人护理产品，合成的表面活性剂具有低临界胶束浓度、高吸附效率、出色的泡沫性和稳定性，同时对皮肤刺激性较小。

目前，丁二酸的生产方法主要有化学合成法和生物发酵法。化学合成法包括石蜡法、顺反二丁烯加氢法、电化学合成法和环烯氧化法等。然而，这些传统生产方法存在诸多不足，例如催化剂昂贵，像某些化学合成过程中使用的稀有金属催化剂，成本高昂且难以回收再利用；生产过程中会排出大量有毒害的副产物，对环境造成严重污染，如电化学合成法会产生含重金属的废水；产率不高，部分化学合成路线复杂，反应步骤多，导致丁二酸的最终产率受限；反应条件苛刻，往往需要高温、高压等极端条件，不仅增加了生产设备的成本投入，还提高了能源消耗。

随着人们对环境保护和可持续发展的关注度不断提高，利用微生物发酵生产丁二酸的生物法逐渐成为研究热点。生物合成法具有原料属于可再生资源的显著特点，其生产原料通常来自于生物质，如玉米淀粉、木质纤维素等，这些资源可以通过植物的光合作用不断再生，减少了对有限化石资源的依赖。而且，发酵过程还能吸收二氧化碳，据研究，每生产1吨丁二酸，大约可固定1.3吨二氧化碳，有助于缓解温室气体排放问题，拥有绿色环保的优势。在众多用于丁二酸生产的微生物中，大肠杆菌因其独特的优势脱颖而出。大肠杆菌营养要求低，在无机盐培养基中就能良好生长，对原料中酵母粉和蛋白胨的需求少，从而降低了生产成本。同时，大肠杆菌遗传背景清晰，容易进行改造，通过基因工程技术可以对其代谢途径进行精准调控，提高丁二酸的产量和生产效率。例如，通过敲除副产物代谢相关基因，如poxb（编码丙酮酸氧化酶）、pta（编码磷酸转乙酰基酶）、ldha（编码乳酸脱氢酶）、adhe（编码乙醇脱氢酶）、pflb（编码丙酮酸-甲酸裂解酶）等，可有效减少乙酸、乳酸、乙醇和甲酸等副产物的生成，使代谢流更多地流向丁二酸的合成；通过表达pcka基因（编码pep羧化激酶）、ppc基因（编码pep羧化酶）、pyc基因（编码丙酮酸羧化酶）等，强化二氧化碳的固定，增强丙酮酸/磷酸烯醇式丙酮酸转化成草酰乙酸的能力，从而促进丁二酸的生成。

因此，开展产丁二酸大肠杆菌的代谢工程与发酵调控研究，对于提高丁二酸的生产效率、降低生产成本、推动丁二酸产业的可持续发展具有重要的现实意义。一方面，通过代谢工程改造，可以进一步优化大肠杆菌的丁二酸合成代谢途径，提高丁二酸的产量和糖酸转化率，增强其在市场上的竞争力；另一方面，通过发酵调控，可以优化发酵条件，如培养基成分、温度、pH值、溶氧等，提高发酵过程的稳定性和丁二酸的生产强度，为丁二酸的大规模工业化生产奠定坚实的基础。此外，该研究还有助于推动生物制造技术的发展，促进相关领域的技术创新和产业升级，对于实现经济与环境的协调发展具有重要的战略意义。

1.2国内外研究现状

在代谢工程方面，国内外学者已取得了一系列成果。在大肠杆菌中，通过基因敲除技术阻断副产物合成途径是重要研究方向。国外有研究团队敲除pta-ackA基因（编码磷酸转乙酰基酶和乙酸激酶），有效减少了乙酸生成，使得代谢流更多地流向丁二酸合成途径，提高了丁二酸的产量。国内研究也表明，敲除ldhA基因（编码乳酸脱氢酶）后，大肠杆菌发酵过程中乳酸的积累显著降低，从而增加了丁二酸的相对产量。为了增强丁二酸的合成能力，强化关键酶基因表达也是常用策略。国外有研究通过过表达ppc基因（编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶），增强了二氧化碳的固定能力，提高了草酰乙酸的生成量，进而促进了丁二酸的合成。国内学者则通过表达pcka基因（编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶），优化了丁二酸的合成代谢途径，使得丁二酸的产量得到提升。另外，在优化代谢途径方面，国内外研究均有涉及。国外有研究利用合成生物学技术，重新设计大肠杆菌的代谢网络，构建了一条新的丁二酸合成途径，提高了丁二酸的生产效率。国内研究人员通过对大肠杆菌的全局代谢调控，平衡了细胞内的能量代谢和还原力供应，进一步提高了丁二酸