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人重组RIZ1基因真核表达载体构建及在TE-13细胞中的表达与功能研究

一、引言

1.1研究背景与意义

食管癌作为常见的消化道肿瘤，严重威胁人类健康。据统计，全世界每年约有30万人死于食管癌，我国是食管癌高发地区之一，每年平均病死约15万人，且男性多于女性，发病年龄多在40岁以上。食管癌典型症状为进行性吞咽困难，从难咽干食物逐渐发展到连水和唾液都无法咽下，严重影响患者生活质量。

目前，食管癌的治疗方法主要包括手术、放疗和化疗等。对于早期食管癌，外科切除是标准治疗方式，但Ⅰ期、Ⅱa期食管癌临床少见，仅占约18％，术后5年生存率为66.27％；而占比较高（约79％）的Ⅱb、Ⅲ期患者，5年生存率仅为26.7％，多数患者3年内会出现转移或局部复发。且术后化疗或放疗未能有效提高患者预后，术前放化疗虽有一定优势，但仍存在诸多挑战。因此，寻找新的治疗靶点和方法，对于提高食管癌患者的生存率和生活质量具有重要意义。

RIZ1基因作为一个重要的转录调控分子，在肿瘤发生和发展过程中发挥着关键作用。RIZ1能够对基因的转录起到激活和抑制的作用，尤其作为抑制因子时具有重要生物学意义。已有大量研究表明，RIZ1在多种人类原发性肿瘤中存在低表达或表达缺失的情况，如肝癌、乳腺癌、结肠癌等。在食管癌中，RIZ1的表达也明显下降，且其下降程度与肿瘤的分级、浸润和转移程度密切相关。RIZ1可导致G2/M期阻滞并诱导细胞凋亡，进而抑制肿瘤细胞的生长。将腺病毒介导的RIZ1感染肝癌细胞系HuH2，发现感染后的细胞生长缓慢，72小时出现死亡，且48小时后出现细胞G2/M期阻滞，72小时出现细胞凋亡现象，凋亡程度与感染的AdRIZ1的量成正相关。在乳腺癌细胞系UTA6中也观察到类似结果。

构建人重组RIZ1基因真核表达载体，能够为进一步研究RIZ1基因的功能和作用机制提供有力工具。通过将该表达载体导入食管癌TE-13细胞中，研究其表达情况及对细胞增殖、凋亡等生物学行为的影响，有助于深入揭示RIZ1基因在食管癌发生发展中的作用机制，为食管癌的基因治疗提供新的理论依据和潜在靶点，有望为食管癌的治疗开辟新的途径，改善患者的预后。

1.2国内外研究现状

在国外，对RIZ1基因的研究起步较早。早期研究就已明确RIZ1基因位于1p36.2区域，该区域在多种肿瘤中常发生缺失，暗示了RIZ1基因与肿瘤的密切关联。大量研究表明，RIZ1基因在乳腺癌、肺癌、结肠癌等多种恶性肿瘤组织及细胞系中存在表达缺失或低表达的情况。有研究通过对乳腺癌细胞系的深入分析，发现RIZ1基因表达缺失会导致细胞周期调控紊乱，使得细胞更容易进入增殖周期，从而促进肿瘤细胞的生长和增殖。在肺癌研究中也发现，RIZ1基因的低表达与肺癌的恶性程度和转移潜能相关，低表达的RIZ1基因无法有效抑制肺癌细胞的侵袭和转移。

在真核表达载体构建方面，国外已发展出多种成熟的技术和方法。以常用的pcDNA3.1载体为例，通过巧妙设计引物，利用PCR技术扩增目的基因片段，再借助限制性内切酶和DNA连接酶，能够高效地将目的基因克隆到载体上，构建出真核表达载体。并且，国外在载体构建后的鉴定技术上也较为先进，除了传统的酶切鉴定、PCR鉴定外，还广泛应用DNA测序技术，确保构建的载体序列准确无误，为后续的基因功能研究提供可靠保障。

在肿瘤细胞研究领域，国外学者利用构建的RIZ1基因真核表达载体转染肿瘤细胞，深入探究RIZ1基因对肿瘤细胞生物学行为的影响。如在肝癌细胞系的研究中，将携带RIZ1基因的真核表达载体导入肝癌细胞后，发现肝癌细胞的增殖速度明显减缓，细胞凋亡率显著增加，进一步研究发现这一过程与RIZ1基因调控细胞周期相关蛋白的表达密切相关。在神经母细胞瘤细胞系中，RIZ1基因的过表达能够抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，通过对相关信号通路的研究，揭示了RIZ1基因可能通过抑制PI3K/AKT信号通路来发挥其抑制肿瘤细胞迁移和侵袭的作用。

国内对于RIZ1基因的研究也取得了一系列成果。在食管癌研究方面，有研究采用甲基化特异性PCR技术，对人食管鳞癌组织及其相应癌旁组织、正常组织中RIZ1基因启动子区CpG岛的甲基化状态进行检测，发现食管鳞癌组织中RIZ1基因启动子区CpG岛的甲基化发生率显著高于癌旁组织及正常组织，且甲基化状态与食管鳞癌的发生密切相关。通过Westernblot和RT-PCR方法检测人食管鳞癌细胞株TE13中RIZ1基因的表达水平，发现其明显低于正常食管组织，进一步研究表明，转染RIZ1表达