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猪链球菌2型EF与MRP基因串联表达及间接ELISA诊断方法的构建与评估

一、引言

1.1研究背景与意义

猪链球菌病是由猪链球菌（Streptococcussuis）引起的一种重要的人畜共患传染病。在猪链球菌的众多血清型中，猪链球菌2型（Streptococcussuistype2，SS2）致病性最强，危害也最为严重。其不但能引发猪的急性败血症、脑膜炎、关节炎甚至导致死亡，还可使养猪从业人员感染发病甚至死亡，给养猪业、食品安全和公共卫生带来极大危害。

在养猪业方面，猪链球菌2型感染会导致猪群出现较高的发病率和死亡率。急性发病时，患病猪可能在毫无预兆的情况下突然死亡；部分病猪会表现出精神不振、发热、食欲不振、呼吸困难等症状，严重影响猪的生长发育和养殖效益。如在一些规模化养猪场，一旦发生猪链球菌2型疫情，常常会造成大量猪只发病死亡，给养殖户带来巨大的经济损失。而且，为了防控疫情，养殖场还需要投入大量的人力、物力和财力用于疫病监测、消毒、药物治疗等，进一步增加了养殖成本。

从公共卫生角度来看，人感染猪链球菌2型后，可引发脑膜炎、败血症、心内膜炎、关节炎和肺炎等严重疾病，严重威胁人类健康。例如，2005年四川发生的猪链球菌病疫情，造成了两百多人感染，30多人死亡，引起了社会的广泛关注。人主要通过破损皮肤、创口感染，如在饲养、贩运、屠宰、加工感染猪链球菌病的猪只时，若皮肤有破损，就容易接触感染；也可通过消化道感染，食用未煮熟的病死猪肉或者变质腐烂猪肉就存在感染风险。

目前，诊断猪链球菌2型感染的方法众多，如细菌分离培养、PCR检测、血清学检测等。其中，血清学检测方法因具有快速、灵敏、特异性强等优点而被广泛应用。而在血清学检测中，抗原的选择至关重要。

胞外蛋白因子（Extracellularproteinfactor，EF）和溶菌酶释放蛋白（Muramidasereleasedprotein，MRP）是猪链球菌2型的两种最重要的毒力因子。EF通常存在于培养基的上清液中，相对分子质量为110000；MRP通常存在于原生质体或培养基的上清液中，由1208个氨基酸组成，相对分子质量约为136000。研究表明，致病性较高的猪链球菌2型基本上都携带EF和MRP。这两种毒力因子在猪链球菌2型的致病过程中发挥着关键作用，同时也具有良好的免疫原性，能够刺激机体产生特异性抗体。因此，EF与MRP基因可作为重要的诊断靶标，用于猪链球菌2型感染的诊断。

将EF与MRP基因进行串联表达，构建重组抗原，有望提高抗原的免疫原性和诊断的准确性。基于此重组抗原建立间接ELISA诊断方法，能够实现对猪链球菌2型抗体的快速、准确检测，有助于猪链球菌病的早期诊断和防控，对于保障养猪业的健康发展和公共卫生安全具有重要意义。

1.2国内外研究现状

在国外，对猪链球菌2型EF与MRP基因串联表达及相关ELISA诊断方法的研究开展较早。一些研究团队致力于探究EF和MRP基因的分子结构和功能特性，通过基因测序和生物信息学分析，深入了解其序列特征和保守区域，为后续的基因串联表达奠定了理论基础。例如，有研究精确解析了EF和MRP基因的核苷酸序列，发现它们在不同菌株间具有一定程度的保守性，这使得基于这些基因构建通用诊断方法成为可能。

在基因串联表达方面，国外研究者尝试了多种表达系统和策略。利用大肠杆菌表达系统，将EF与MRP基因成功串联并表达，获得了具有免疫活性的重组蛋白。通过优化表达条件，如诱导剂浓度、诱导时间和温度等，提高了重组蛋白的表达量和可溶性。同时，也对重组蛋白的免疫原性进行了评估，发现其能够刺激机体产生特异性抗体，具有良好的免疫反应性。

在间接ELISA诊断方法的建立上，国外已经有较为成熟的技术和产品。以重组的EF与MRP串联蛋白为抗原，建立了高灵敏度和特异性的间接ELISA检测方法，用于检测猪血清中的猪链球菌2型抗体。这些方法经过大量临床样本的验证，具有较高的准确性和可靠性，能够快速、有效地诊断猪链球菌2型感染。一些商品化的ELISA试剂盒已经在市场上广泛应用，为猪链球菌病的防控提供了有力的技术支持。

在国内，对猪链球菌2型的研究也取得了丰硕的成果。众多科研团队对猪链球菌2型的分离鉴定、毒力因子分析、流行病学调查等方面进行了深入研究。在EF与MRP基因的研究中，国内学者通过PCR扩增、克隆和测序等技术，对不同地区分离的猪链球菌2型菌株的EF和MRP基因进行了分析，发现我国菌株的基因序列与国外参考菌株具有高度同源性。

在基因串联表达研究方面，国内科研人员同样进行