精准诊断猪疫新径：猪流行性腹泻病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测体系的构建与实践.docxVIP

精准诊断猪疫新径：猪流行性腹泻病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测体系的构建与实践

一、引言

1.1研究背景

猪流行性腹泻（PorcineEpidemicDiarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（PorcineEpidemicDiarrheaVirus，PEDV）引起的一种急性、高度接触性肠道传染病。临床上以呕吐、水样腹泻、脱水和哺乳仔猪的高死亡率为主要特征，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。

PEDV属于冠状病毒科α冠状病毒属，其基因组为单股正链RNA。该病毒于1971年在英国首次被发现，随后在世界范围内广泛传播。2010年末，PEDV变异毒株在我国大肆流行，此次疫情几乎席卷了我国所有省份的养猪场，发病率高达100%，仔猪死亡率更是高达50%-90%。大量仔猪死亡不仅直接导致养殖数量减少，还打乱了正常的养殖生产节律，如母猪提前断奶、发情周期紊乱，增加了管理难度和成本。同时，为防控疫情，猪场需投入大量人力、物力进行消毒、隔离等措施，进一步增加了养殖成本。在国际上，美国、韩国、日本等养猪业发达的国家也多次遭受PEDV的侵袭，对其养猪产业造成了沉重打击。

猪群一旦感染PEDV，病毒可在猪舍内迅速传播。病猪的粪便、呕吐物以及口鼻分泌物中含有大量病毒，健康猪通过接触被污染的饲料、饮水、器具等，经口感染病毒。此外，PEDV还可通过空气传播，在猪群密集的养殖场，病毒可通过气溶胶形式在猪舍内扩散，导致疫情快速蔓延。而且，该病毒具有较强的环境抵抗力，在低温、潮湿的环境中可存活较长时间，这也增加了防控的难度。

目前，虽然市场上有一些针对PEDV的疫苗，但由于病毒的不断变异，疫苗的免疫效果受到一定影响。同时，疫苗的使用也存在局限性，如免疫程序复杂、免疫效果参差不齐等。因此，及时准确地检测出PEDV，对于疫情的防控至关重要。快速检测能够使养殖场及时发现感染猪只，采取隔离、扑杀等措施，防止疫情进一步扩散；准确检测则可以避免误诊、漏诊，为科学防控提供依据。然而，传统的检测方法如病毒分离鉴定、免疫荧光试验等，存在操作繁琐、耗时较长、灵敏度低等缺点，难以满足快速诊断和疫情监测的需求。因此，建立一种快速、准确、灵敏的PEDV检测方法具有重要的现实意义。

1.2国内外研究现状

在猪流行性腹泻病毒检测技术的研究上，国内外学者已取得了一系列成果，涵盖了病原学、免疫学和分子生物学等多个领域，不同检测方法各有优劣。

病原学检测方法中，病毒分离培养是经典方法，它通过将病毒接种到合适的细胞系中，观察细胞病变效应（CPE）来确定病毒的存在。这种方法的优点是能够直接获得活病毒，可用于病毒的生物学特性研究和疫苗制备，是病毒检测的“金标准”。例如，在早期对PEDV的研究中，通过将采集的病料接种到Vero细胞中，成功分离出病毒，为后续研究奠定了基础。但病毒分离培养操作繁琐，需要专业的细胞培养设备和技术人员，且培养周期长，一般需要3-7天，对病毒的活性要求高，容易受到样本中其他因素的干扰，不适用于快速诊断和大规模检测。

免疫学检测方法以酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫荧光试验（IFA）为代表。ELISA是利用抗原与抗体的特异性结合，通过酶标记物催化底物显色来检测样本中的病毒抗原或抗体。该方法具有操作简便、可批量检测、成本较低等优点，适用于大规模的血清学调查和抗体监测。如间接ELISA可用于检测猪血清中的PEDV抗体水平，以评估猪群的免疫状态。然而，ELISA的灵敏度相对较低，易出现假阳性或假阴性结果，对低水平感染的检测能力有限。IFA则是将荧光素标记的抗体与样本中的病毒抗原结合，在荧光显微镜下观察荧光信号来判断结果。它具有较高的特异性，能够直观地观察到病毒在细胞内的定位和感染情况，但需要荧光显微镜等设备，操作过程较为复杂，对操作人员的技术要求较高，且不适用于大批量样本的检测。

分子生物学检测方法近年来发展迅速，包括聚合酶链式反应（PCR）、环介导等温扩增技术（LAMP）和TaqMan荧光定量RT-PCR等。PCR技术通过设计特异性引物，对病毒的核酸进行扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳观察扩增条带的大小来判断结果。常规PCR具有灵敏度高、特异性强的特点，能够检测出微量的病毒核酸。巢式PCR在普通PCR的基础上增加了一轮扩增，进一步提高了检测的灵敏度和特异性，可检测到低至50fg的PEDVRNA模板。但常规PCR操作步骤较多，易出现交叉污染，且只能定性检测，无法准确判断病毒的含量。LAMP技术是一种等温扩增技术，在恒温条件下即可完成核酸扩增，具有操作简单、反应速度快、不需要特殊设备等优点。如建立的PEDVRT-LAMP可视化检测方法，可在