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东方泰勒虫直接PCR检测方法：构建、验证与应用

一、引言

1.1研究背景

泰勒虫病是一种由泰勒虫属（Theileria）寄生虫引起的蜱传性血液原虫病，主要感染牛、羊等家畜，呈全球性分布，对畜牧业造成了巨大的经济损失。在热带和亚热带地区，泰勒虫病的流行尤为严重，给当地的畜牧业发展带来了严峻挑战。据统计，全球每年因泰勒虫病导致的经济损失高达数十亿美元，包括家畜死亡、生产性能下降、治疗费用以及防控措施的投入等。

在中国，泰勒虫病的流行也较为广泛，多个地区均有报道。新疆阿克苏地区柯坪县和阿瓦提县羊泰勒虫病的PCR总阳性率高达84.6％；吉林延边地区牛瑟氏泰勒虫病的感染率也处于较高水平。泰勒虫病的发生不仅影响家畜的健康和生长发育，导致肉、奶、毛等畜产品产量和质量下降，还会增加养殖成本，降低养殖户的经济效益，严重制约了畜牧业的可持续发展。

传统的泰勒虫病诊断方法主要包括血涂片镜检法、动物接种试验和血清学方法等。血涂片镜检法是最常用的诊断方法之一，它通过将血液样本制成涂片，经过染色后在显微镜下观察虫体形态来判断是否感染泰勒虫。然而，该方法存在明显的局限性，当血液中的虫体数量较少时，很容易出现漏检的情况，导致诊断结果不准确；动物接种试验虽然准确性较高，但操作繁琐、耗时较长，且需要使用实验动物，成本较高，难以在实际生产中广泛应用；血清学方法如酶联免疫吸附试验（ELISA）等，虽然具有一定的灵敏度和特异性，但容易受到交叉反应的影响，导致假阳性或假阴性结果的出现。

随着分子生物学技术的快速发展，聚合酶链式反应（PCR）技术因其具有灵敏度高、特异性强、快速准确等优点，在寄生虫病诊断中得到了广泛应用。PCR技术能够检测出样本中微量的病原体DNA，大大提高了诊断的准确性和敏感性。在泰勒虫病的诊断研究中，已经有多种基于PCR技术的检测方法被报道，如普通PCR、巢式PCR、实时荧光定量PCR等。这些方法在泰勒虫病的诊断和流行病学调查中发挥了重要作用，但仍存在一些不足之处。部分PCR检测方法的引物特异性不够高，可能会导致与其他病原体的DNA发生交叉反应，影响检测结果的准确性；一些检测方法的操作过程较为复杂，需要专业的技术人员和昂贵的仪器设备，限制了其在基层实验室和现场检测中的应用。

东方泰勒虫（Theileriaorientalis）是泰勒虫属中的一种重要病原体，可感染牛、羊等反刍动物，引起发热、贫血、黄疸、消瘦等症状，严重时可导致死亡。近年来，随着畜牧业的规模化和集约化发展，东方泰勒虫病的流行范围逐渐扩大，感染率呈上升趋势，给畜牧业带来了越来越大的威胁。因此，建立一种快速、准确、特异的东方泰勒虫直接PCR检测方法，对于东方泰勒虫病的早期诊断、疫情监测和防控具有重要的现实意义。

1.2国内外研究现状

在泰勒虫病的检测领域，国内外学者已开展了大量研究，致力于寻找高效、准确的检测方法，以应对泰勒虫病对畜牧业的威胁。

国外在泰勒虫病检测方面起步较早，研究成果较为丰富。早在1992年，Bishop等人首次将PCR技术应用于泰勒虫病的诊断，开启了分子生物学技术在该领域应用的新篇章。随后，Oliveira等使用裂殖子主要表面抗原（Tamsl）特异性引物，对92份牛血样进行环形泰勒虫的PCR检测，其检出率高达75％，显著高于血涂片镜检法（22％）和免疫荧光抗体检测（40％），充分展示了PCR技术在泰勒虫检测中的高灵敏度优势。此后，多种基于PCR技术的检测方法不断涌现，如实时荧光定量PCR、巢式PCR等。实时荧光定量PCR能够实现对病原体核酸的定量检测，在疾病的早期诊断和病情监测方面具有重要意义；巢式PCR则通过两轮PCR扩增，进一步提高了检测的灵敏度和特异性，能够检测出更低含量的病原体DNA。

国内对于泰勒虫病检测方法的研究也在不断深入。针对牛环形泰勒虫病，有研究以环形泰勒虫裂殖体表面蛋白（TaSP）基因为靶标序列，根据GenBank登录的牛环形泰勒虫TaSP基因序列保守区设计合成引物，建立了诊断牛环形泰勒虫病的PCR方法。该方法利用TaSP基因良好的免疫原性和在分子诊断方面的重要价值，为环形泰勒虫病的诊断提供了新的手段。在牛中华泰勒虫病检测方面，吉林省制定了地方标准DB22/T3366—2022《牛中华泰勒虫病检测PCR法》，规定了牛中华泰勒虫病PCR检测方法的试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤、结果判定和废弃物处理等内容，适用于牛中华泰勒虫核酸检测，为该地区牛中华泰勒虫病的诊断提供了标准化的操作流程。此外，还有研究通过设计特异性引物和探针，建立了马泰勒虫荧光定量PCR检测方法，并对伊犁地区马泰勒虫病进行了分子流行病学调查，有助于掌握该地