基于RNA-Seq策略剖析天然反义转录本调控机制：从理论到实践.docxVIP

基于RNA-Seq策略剖析天然反义转录本调控机制：从理论到实践

一、引言

1.1研究背景

1.1.1RNA-Seq技术发展历程

RNA-Seq技术作为转录组学研究的关键手段，其发展历程见证了生命科学领域的重大变革。20世纪70年代，Sanger测序技术的诞生开启了测序时代的大门，为后续技术的发展奠定了基础。但该技术通量低、成本高，难以满足大规模转录组研究的需求。进入21世纪，第二代测序技术（NGS）迅猛发展，以Roche454、IlluminaSolexa和ABISOLiD为代表的测序平台，凭借其高通量、低成本的优势，彻底改变了生物学研究的格局，RNA-Seq技术也应运而生。

早期的RNA-Seq技术主要聚焦于基因表达谱的分析，通过对转录本的测序，能够准确测量基因的表达水平，揭示不同组织、不同发育阶段以及不同生理病理条件下基因表达的差异。随着技术的不断成熟，研究人员开始利用RNA-Seq技术探索更多的生物学问题，如发现新的转录本、研究可变剪接事件等。在发现新转录本方面，RNA-Seq技术能够检测到传统方法难以发现的低丰度转录本，为基因组注释的完善提供了重要依据；在可变剪接研究中，通过对测序数据的分析，可以识别出不同的剪接异构体，深入了解基因表达调控的复杂性。

为了进一步提高RNA-Seq技术的应用范围和精度，科学家们不断对文库制备方法、测序技术和数据分析算法进行改进。在文库制备方面，开发了多种特异性富集或去除特定RNA分子的方法，以提高测序数据的质量和有效性。例如，使用Oligo(dT)磁珠富集mRNA，可有效去除大量的rRNA，提高mRNA的测序比例；而针对非编码RNA的研究，则开发了相应的富集方法，如smallRNA文库制备技术，专门用于研究microRNA等小分子非编码RNA。在测序技术上，长读长测序技术的出现弥补了短读长测序的不足，能够直接测定较长的转录本序列，更准确地解析复杂的转录本结构和可变剪接事件。PacBio的单分子实时测序（SMRT）技术和OxfordNanopore的纳米孔测序技术，能够产生数千碱基甚至更长的读长，使得对全长转录本的研究成为可能。同时，直接RNA测序技术的发展，避免了传统方法中cDNA合成步骤可能引入的偏差，为RNA研究提供了更直接、更准确的数据。

在数据分析算法方面，随着测序数据量的爆炸式增长，开发高效、准确的数据分析工具成为当务之急。一系列用于RNA-Seq数据分析的软件和算法相继问世，如TopHat、Cufflinks、DESeq2、edgeR等，它们能够实现从原始测序数据的质量控制、序列比对、表达量计算到差异表达分析等一系列复杂的分析流程，极大地推动了RNA-Seq技术在生物学研究中的广泛应用。

1.1.2天然反义转录本研究现状

天然反义转录本（NaturalAntisenseTranscripts，NATs）是一类广泛存在于生物体内的RNA分子，其序列与相应的正义转录本互补。随着高通量测序技术的发展，越来越多的研究表明NATs在原核和真核生物基因组中普遍存在。在植物和动物基因组中，7%-30%的基因存在NATs，而在人和小鼠转录基因组中，高达72%的转录本有反义RNA。

NATs在基因表达调控中发挥着至关重要的作用，其调控机制涉及多个层面。在转录水平，NATs可通过转录干扰影响正义基因的转录起始、延伸和终止。当NATs与正义基因的启动子区域重叠时，它们可能竞争转录因子或RNA聚合酶的结合位点，从而抑制正义基因的转录。研究发现某些基因的反义转录本能够与正义基因的启动子形成DNA-RNA三链结构，阻碍转录的起始。在转录后水平，NATs与正义转录本通过碱基互补配对形成双链RNA，进而影响mRNA的稳定性、运输、翻译以及可变剪接等过程。双链RNA可以被核酸酶识别并降解，导致mRNA稳定性降低；也可能影响mRNA与核糖体的结合，抑制翻译过程；此外，还可能通过影响剪接因子的结合，调控mRNA的可变剪接，产生不同的剪接异构体。

NATs还参与了许多重要的生物学过程，如基因组印记、X染色体失活、发育过程调控以及对各种应激的适应和对病毒感染的响应等。在基因组印记中，NATs通过表观遗传修饰机制，如DNA甲基化和组蛋白修饰，调控印记基因的表达，确保基因仅从特定亲本等位基因表达。在发育过程中，NATs对细胞分化、器官形成等过程起到关键的调控作用，它们可以通过调节相关基因的表达，影响细胞的命运决定和组织器官的发育进程。在应激响应方面，当生物体受到外界环境刺激，如温度、病原体感染等，NATs的表达会发生变化