高效液相色谱分析课件.pptVIP

生物工業分析高效液相色譜分析第一節基本原理一、液相色譜過程1．流程圖高效液相色譜的流程如圖8-1所示。高壓泵輸送流動相和試樣組分高速流過色譜分離柱時，具有不同分配係數的組分在兩相間經過反復多次的分配平衡時被分離，通過檢測器時被檢測並給出信號。高效液相色譜分析高壓輸液泵高壓泵是高效液相色譜的動力源，用來使液體流動相高速通過色譜分離柱以達到快速分析的目的。在高效液相色譜中，通常使用往復式柱塞泵，結構如圖8－2所示。高效液相色譜分析梯度淋洗裝置梯度淋洗就是流動相中含有兩種或多種不同極性的溶劑，在分離過程中按一定程式連續改變流動相中溶劑的配比和極性，使被分離組分在兩相中的分配係數改變，達到提高分離效果，調節出峰時間的目的。兩種方式來實現：外梯度（也稱低壓梯度）和內梯度（也稱高壓梯度），外梯度是在常壓下，按一定程式將溶劑混合後再通過高壓泵輸入色譜柱；內梯度是利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合後進入色譜柱。進樣裝置高效液相色譜是在很高的壓力狀態下工作的，通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置，其結構如圖8－3所示。高效液相色譜分析高效分離柱高效液相色譜的分離柱具有很高的柱效，理論塔板數達每米3萬。柱體為直型不銹鋼管，內徑l～6nm，柱長5～40cm。液相色譜柱的發展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效，因此柱較短。高效液相色譜分析高效液相色譜檢測器紫外光度檢測器最小檢測量可達10-9g·mL-1，對流量和溫度的波動不敏感，可用於梯度洗脫。其原理是基於試樣中各組分對特定波長的紫外光有選擇性吸收，組分濃度與吸光度之間服從朗伯-比耳定律，因此要求在測定波長處，流動相應無明顯的吸收，而被測組分應有較大的吸光係數。紫外光度檢測器有固定波長和可變波長兩種，前者的測定波長固定（254nm或280nm），適用於芳烴化合物的檢測。後者可根據試樣選擇測定波長，方便靈活適用面廣。紫外光度檢測器的光路圖如圖8-4所示。高效液相色譜分析光電二極體陣列檢測器，由211個（或更多）二極體組成陣列，各檢測特定波長，將吸收後透過的紫外光束分光投射到二極體陣列上，用電腦快速處理，可獲更多資訊及顯示吸光度、波長、時間三維立體譜圖，如圖8-5所示。高效液相色譜分析差示折光檢測器差示折光檢測器的最低檢測量達10-7g·mL-1，對溫度變化敏感，不能用於梯度洗脫。其原理是基於含有被測組分的流動相和純流動相的溶液折射率之差與被測組分在流動相中的濃度有關，可根據流動相折射率的變化，測定試樣組份含量。高效液相色譜法還可利用其高效分離的特點，將柱後流出組分分別收集，蒸去流動相，獲得難於通過一般方法製備的高純度樣品（色譜純）。液相色譜製造技術要求高，儀器價格、操作、維護費用也相對較高，故遠沒有氣相色譜的普及程度高。高效液相色譜分析2．高效液相色譜法的主要分離類型（1）吸附色譜（液--固吸附色譜）：以固體吸附劑為固定相，流動相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。分離原理是組分在兩相間經過反復多次的吸附與解吸分配平衡。（2）分配色譜（液--液分配色譜）：早期通過在擔體上徐漬一薄層固定液製備固定相，與流動相一起構成液液兩相，各組分在兩相間分配係數的不同，經反復多次分配平衡而實現分離。現多為化學鍵合固定相，即用化學反應的方法通過化學鍵將固定液結合在擔體表面。通常反應發生在矽膠表面的≡Si－OH基團上，形成矽氧碳鍵型（≡Si-O-C），矽氧矽碳型（≡Si-OSi-C），矽碳型（≡Si-C）,矽氮型（≡Si-N）四種類型。高效液相色譜分析（3）離子交換色譜：固定相為離子交換樹脂（H+或OH-），流動相為無機酸或無機堿的水溶液。各種離子因它們與樹脂上的交換基團的交換能力的不同而得到分離。（4）凝膠色譜（空間排阻色譜）：以凝膠為固定相。凝膠色譜法又稱凝膠滲透法、凝膠過濾法。當試樣隨流動相進入分離柱時，試樣中的小分子擴散、滲透到孔穴內部，而大分子則被排阻在孔穴之外，不同大小的分子，可通過的孔穴大小、數目不同，走過的路徑和需要的時間不同，被排阻的大分子首先被流動相帶出，其他不同大小的分子依次流出。高效液相色譜分析二、色譜流出曲線試樣中各組分經色譜柱分離後，隨流動相依次流出色譜拄，經檢測器轉換為電訊號，然後用記錄儀將各組分的濃度變化記錄下來，即得色譜圖。色譜圖是以組分的濃度變化作為縱坐標，流出時間作橫坐標的，這種曲線稱為色譜流出曲線。三、色譜中有關術語高效液相色譜法的基本概念及理論基礎，如保留值、分配係數、