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伪狂犬病病毒gE基因于大肠杆菌中的表达及应用研究

一、引言

1.1研究背景与意义

伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由伪狂犬病毒（Pseudorabiesvirus，PRV）引起的一种急性、烈性、高致死性传染病，严重影响着全球养猪业的健康发展。猪作为PRV的唯一自然宿主，感染后会出现多种症状，给养猪业带来巨大的经济损失。妊娠母猪感染后，常发生大面积流产，产出死胎和木乃伊胎，且以产死胎为主，还会出现不发情、返情增加、屡配不孕等情况，这极大地影响了母猪的繁殖性能，降低了猪场的仔猪出生率，增加了养殖成本。新生仔猪感染PRV后，死亡率极高，15日龄内仔猪死亡率可达100%，主要表现为呕吐、腹泻、呼吸困难，部分还会出现神经症状，这不仅导致仔猪大量死亡，还会影响整个猪群的健康和生长发育。断奶仔猪发病死亡率在10-20%，发病率为20%-40%，常表现出观星等神经症状、拉稀、呕吐等，使得仔猪生长缓慢，饲料转化率降低，增加了养殖周期和成本。育肥猪感染后，会出现慢性呼吸道症状、增重迟缓、饲料报酬降低、上市时间推迟等问题，降低了养殖效益。公猪感染后则会出现不育、睾丸肿胀、萎缩等症状，失去种用能力，影响猪场的配种计划和种群质量。

2011年以来，我国许多免疫猪场相继大规模爆发了疑似伪狂犬病，造成妊娠母猪流产和初生乳猪死亡，并迅速蔓延至全国，给养猪业造成了惨重经济损失。此次流行主要是因为伪狂犬毒株发生变异，毒力增强，新毒株与传统毒株基因组序列同源性存在差异。而传统的疫苗对变异毒株不能提供完全保护，这使得伪狂犬病的防控面临更大的挑战。

伪狂犬病毒糖蛋白E（GlycoproteinE，gE）基因在病毒的致病性和免疫原性方面发挥着关键作用。gE基因是伪狂犬病病毒的一个与毒力相关的增殖非必需基因，它的缺失会进一步降低缺失株的毒力而并不阻止缺失株在细胞上的增殖。在野毒感染的猪血清中可以检测到针对gE的抗体，且gE抗体可在感染后1-2周内出现，并可持续至少7个月。因此，gE蛋白可作为主要的诊断抗原，在伪狂犬根除计划中发挥重要作用。通过检测猪血清中gE抗体的存在，可以有效区分野毒感染和疫苗免疫，为伪狂犬病的防控和净化提供重要依据。

在众多的表达系统中，大肠杆菌表达系统以其独特的优势成为生产重组蛋白的常用选择。大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚的特点，其基因组信息丰富，研究人员对其基因功能和调控机制有深入的了解，这使得在进行基因操作时更加准确和高效。它繁殖速度极快，在适宜的条件下，短时间内就能大量增殖，能够快速获得大量的表达产物。成本低廉，其培养条件简单，培养基价格相对较低，不需要复杂的培养设备和环境，大大降低了生产成本，适合大规模工业化生产。表达量高，能够实现高水平的目标蛋白表达，满足大量制备诊断抗原的需求。表达产物容易纯化，通过简单的离心、过滤等操作，结合合适的纯化方法，就能获得高纯度的目标蛋白。稳定性好，在培养过程中不易发生变异，能够保证表达产物的一致性和稳定性。抗污染能力强，对培养环境的要求相对较低，不易受到杂菌的污染。适用范围广，可以表达多种类型的蛋白质，包括病毒蛋白等。利用大肠杆菌表达系统对伪狂犬病病毒gE主要抗原区域进行表达，能够获得大量的、成本较低的诊断抗原，为gE-ELISA试剂盒的研制提供理论依据和实践基础，有助于建立快速、准确、灵敏的血清学鉴别诊断方法，从而有效监测猪群中的伪狂犬病毒感染情况，为伪狂犬病的防控和净化提供有力的技术支持。

1.2国内外研究现状

在国外，伪狂犬病的研究开展较早，对伪狂犬病病毒的分子生物学特性、致病机制等方面有着较为深入的研究。对于gE基因，国外学者早已明确其在病毒致病性和免疫原性中的关键作用，并基于此开发了多种基于gE蛋白的诊断方法，如以抗gE单克隆抗体建立的gE-ELISA鉴别诊断方法在欧洲应用广泛，为伪狂犬病的防控和净化提供了重要的技术支持。在大肠杆菌表达系统表达gE基因方面，也有相关研究探索不同的表达策略和条件优化，以提高gE蛋白的表达量和活性。

国内对伪狂犬病的研究也取得了众多成果。2011年伪狂犬毒株变异引发大规模疫情后，国内加大了对伪狂犬病的研究力度。在gE基因研究上，不仅对其基因序列进行了深入分析，对比不同毒株gE基因的差异，还研究了gE基因在病毒感染和免疫过程中的作用机制。在表达系统方面，大肠杆菌表达系统因其独特优势受到国内研究者的关注。肖少波等人以伪狂犬病病毒Ea株为模板，通过PCR扩增含gE基因主要抗原表位区的片段，将其插入原核表达载体pET-17b的T7噬菌体启动子下游，在大肠杆菌BL21（DE3）中获得了高效表达，表达产物能与Ea