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基因表达载体构建工程师岗位面试问题及答案

请详细说明基因表达载体的基本组成元件及其功能。

答案：基因表达载体的基本组成元件包括启动子、终止子、目的基因、标记基因和复制原点。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录；终止子提供转录终止信号；目的基因是需表达的特定基因；标记基因用于筛选含有载体的细胞；复制原点保证载体在宿主细胞中自主复制。

在构建基因表达载体时，如何选择合适的限制性内切酶？

答案：选择合适的限制性内切酶需要考虑目的基因和载体上的酶切位点，优先选择在目的基因两端和载体多克隆位点中都存在、且酶切后产生互补粘性末端或平末端的限制性内切酶，同时要避免酶切位点在目的基因内部出现，防止破坏基因序列，还需考虑酶的活性、反应条件及价格等因素。

简述PCR扩增目的基因在基因表达载体构建中的作用及操作要点。

答案：PCR扩增目的基因在基因表达载体构建中用于获取大量特异性的目的基因片段。操作要点包括设计合适的引物，引物需包含合适的酶切位点便于后续与载体连接；优化PCR反应体系，如调整DNA模板、引物、dNTP、Taq酶的用量，以及合适的退火温度等；确保PCR产物的特异性和纯度，可通过琼脂糖凝胶电泳检测和回收目的条带。

当基因表达载体构建后，如何验证其是否成功？

答案：可通过多种方法验证基因表达载体是否成功构建。首先进行酶切鉴定，用构建时使用的限制性内切酶对重组载体进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳观察是否能切出预期大小的目的基因片段和载体片段；其次进行PCR鉴定，以重组载体为模板，用目的基因特异性引物进行PCR扩增，检测能否得到预期大小的产物；还可进行测序鉴定，将重组载体送测序，与目的基因序列比对，确认基因序列及连接方向是否正确。

请说明原核表达载体和真核表达载体的主要区别。

答案：原核表达载体和真核表达载体的主要区别在于启动子、转录调控元件、翻译起始信号及复制元件等方面。原核表达载体使用原核生物的启动子，如T7启动子等，转录调控简单，翻译起始依赖SD序列，复制依赖原核生物的复制原点；真核表达载体使用真核生物的启动子，如CMV启动子等，转录调控复杂，存在内含子和外显子的剪切机制，翻译起始依赖帽子结构，复制依赖真核生物的复制原点，且部分真核表达载体还需包含增强子等元件来增强基因表达。

在基因表达载体构建过程中，如何避免载体自身环化？

答案：避免载体自身环化可采用多种方法。一是使用不同的限制性内切酶对目的基因和载体进行双酶切，产生不同的粘性末端，这样载体和目的基因只能按特定方向连接，减少自身环化；二是对载体进行去磷酸化处理，用碱性磷酸酶去除载体末端的5’磷酸基团，使载体不能自身连接，只有与带磷酸基团的目的基因连接后才能形成完整的磷酸二酯键；三是控制载体和目的基因的连接比例，避免载体过量导致自身环化。

若在基因表达载体构建后，转化宿主细胞效率低，可能的原因有哪些？如何解决？

答案：转化宿主细胞效率低可能的原因包括宿主细胞状态不佳，如细胞老化、活力低；载体浓度过高或过低；转化方法不合适；操作过程中污染等。解决方法有使用新鲜培养、处于对数生长期的宿主细胞；优化载体与宿主细胞的比例，调整载体浓度；根据宿主细胞类型选择合适的转化方法，如化学转化法、电穿孔法等，并优化转化条件；严格遵守无菌操作规范，防止污染。

请阐述基因表达载体构建中融合标签的作用及常用的融合标签有哪些？

答案：基因表达载体构建中融合标签的作用主要是便于目的蛋白的表达、检测、纯化和定位。通过与目的蛋白融合表达，可增加蛋白的可溶性，防止蛋白降解；利用标签的特异性抗体或结合特性，可进行Westernblot等检测；常用的亲和层析方法可利用标签与配体的特异性结合进行蛋白纯化；某些荧光标签还可用于蛋白的细胞定位研究。常用的融合标签有His标签（组氨酸标签），便于通过镍柱进行亲和纯化；GST标签（谷胱甘肽S-转移酶标签），可利用谷胱甘肽琼脂糖珠纯化；GFP标签（绿色荧光蛋白标签），用于蛋白的荧光检测和定位。

如何保证基因表达载体在宿主细胞中稳定表达？

答案：保证基因表达载体在宿主细胞中稳定表达可从多个方面着手。首先选择合适的载体，如含有稳定复制原点和选择标记的载体，通过选择压力（如抗生素抗性）筛选含有载体的细胞，使载体在细胞分裂过程中稳定遗传；其次优化启动子和增强子元件，确保基因能够持续转录；再者避免基因表达产物对宿主细胞有毒性，可通过诱导表达系统控制基因表达时间和水平；还需考虑宿主细胞的特性，选择与载体兼容、能够稳定支持载体表达的宿主细胞。

在基因表达载体构建中，如何处理目的基因中存在的稀有密码子问题？

答案：处理目的基因中存在的稀有密码子问题，可采用密码子优化技术，根据宿主细胞的密码子偏好性，将稀有密码子替