杂交瘤技术制备单克隆抗体.pptVIP

杂交瘤技术制备单克隆抗体第1页，共38页，星期日，2025年，2月5日单克隆抗体（McAb）：是由只识别单一抗原决定簇的B细胞克隆产生的同源抗体。理化性状高度均一效价高只与一种抗原表位发生反应、生物活性单一具有高度特异性又易于大量制备第2页，共38页，星期日，2025年，2月5日如何获得McAb?如何大量获得McAb?需要克服哪些技术问题？第3页，共38页，星期日，2025年，2月5日理想的抗体分泌细胞：具有合成和分泌抗体的能力具有大量无限生长的特性第4页，共38页，星期日，2025年，2月5日在1975年，Kohler和Milstein将来源于小鼠骨髓的骨髓瘤细胞和啮齿动物可以分泌抗体的细胞融合后形成杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞具有肿瘤细胞无限繁殖的能力，也具有免疫细胞分泌抗体的能力，后来将这种杂交细胞系统统称为杂交瘤（hybridoma）。通过筛选，分离得到针对特异性抗原并具有所要求的抗体亲和力的杂交瘤细胞。在适当营养条件下，杂交瘤细胞能够生长和无限制性传代，并且能产生大量单一类型的抗体及单克隆抗体。第5页，共38页，星期日，2025年，2月5日一、杂交瘤技术的基本原理二、单克隆抗体的制备三、单克隆抗体的应用第6页，共38页，星期日，2025年，2月5日一杂交瘤技术的基本原理利用聚乙二醇作为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细?胞与具有在体外不断繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一?体，在HAT选择性培养基的作用下，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经过反复的免疫学检测筛选和单个细胞培养（克隆化）,最终获得既能产生所需单克隆抗体,又能不断繁殖的杂交瘤?细胞系，将这种细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在其产生的腹水中即可得到高效价的单克隆抗体。第7页，共38页，星期日，2025年，2月5日流程杂交瘤技术第8页，共38页，星期日，2025年，2月5日1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，可溶性抗原10-50ug/100ul+等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔，2-4周后加强免疫（量减半，改用不完全佐剂，可反复多次）冲击免疫（融合前3天进行）选用6-12周龄Balb/c小鼠免疫方案第9页，共38页，星期日，2025年，2月5日不产生Ig的重链和轻链HGPRT-与提供淋巴细胞的动物品系相同小鼠骨髓瘤细胞第10页，共38页，星期日，2025年，2月5日处于免疫状态脾脏中的B淋巴母细胞或浆母细胞动物：6～12周龄20g～25g体重免疫脾细胞第11页，共38页，星期日，2025年，2月5日细胞融合剂：PEG:分子量4000的PEG是最常用的细胞融合剂作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合作用特点：不同的分子质量、浓度、作用时间、pH,可能直接影响融合效果细胞融合第12页，共38页，星期日，2025年，2月5日培养骨髓瘤细胞：对数生长期浑圆、透亮、均一、排列整齐避免细胞返祖：定期用8-AG处理细胞1-2×107免疫脾细胞的制备：1-2×108无菌手术第13页，共38页，星期日，2025年，2月5日饲养细胞：常用小鼠腹腔巨噬细胞，5-8×106分泌细胞生长因子吞噬衰老细胞和微生物存活一般不超2周，不影响杂交瘤细胞的纯化第14页，共38页，星期日，2025年，2月5日杂交瘤细胞的选择性培养细胞DNA合成途经：1.替代途径：次黄嘌呤（H）HGPRT2.主要途径：氨基酸鸟嘌呤核苷酸谷氨酰胺（A-）尿核苷单磷酸胸腺嘧啶核苷酸TK3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（T）第15页，共38页，星期日，2025年，2月5日HAT培养基：H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNAHAT选择培养基的原理第16页，共38页，星期日，2025年，2月5日HAT选择作用：淋巴细胞：不能生长，5