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细胞生长曲线法可观察同一代细胞的增殖过程。根据生长曲线分析细胞增殖速度，确定具体实验﹑细胞传代的最佳时间。方法总培养时间7天计数每24小时细胞数目绘制细胞生长曲线潜伏期原代细胞24-96h传代细胞6-24h对数生长期3-5d倍增时间停滞期**第31页，共78页，星期日，2025年，2月5日3H-TdR掺入法3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷掺入到细胞新合成的DNA中，通过测定3H放射性脉冲数，计算细胞的增殖活性。特点被标记的细胞为S期细胞，3H-TdR掺入量放映DNA合成的快慢。放射性损害。需要特殊实验室和特殊设备。**第32页，共78页，星期日，2025年，2月5日细胞培养中的传代换液问题原代培养后的第一次传代原代培养方法细胞活性细胞类型和特点接种密度培养条件常规传代传代时间对数生长期传代比例原瓶细胞分于2-4瓶贴壁细胞酶充分消化**第33页，共78页，星期日，2025年，2月5日二.角质形成细胞培养问题**第34页，共78页，星期日，2025年，2月5日角质形成细胞培养方法组织块培养法3T3细胞为滋养层培养法胶原为滋养层培养法气—液交界面培养法无血清培养法**第35页，共78页，星期日，2025年，2月5日组织块培养法将表皮块贴附在培养瓶壁上,角质形成细胞逐渐从组织块边缘爬行长出。特点稳定可靠获得的细胞数量有限细胞生长周期长成纤维细胞污染**第36页，共78页，星期日，2025年，2月5日3T3细胞滋养层培养法3T3细胞经丝裂霉素C或γ-射线预处理(失去分裂增殖功能)后,低密度接种在培养瓶壁上,再将角质形成细胞种植在此细胞滋养层上。3T3细胞小鼠胚胎瘤成纤维细胞株滋养层作用促使角质形成细胞的贴附和生长,并形成集落,最后融合成复层鳞状上皮接触性抑制成纤维细胞生长**第37页，共78页，星期日，2025年，2月5日3T3细胞促进角质形成细胞粘附和生长的途径:产生基质成分,促进角质形成细胞贴壁。分泌促进角质形成细胞有丝分裂的活性因子。通过细胞间相互作用,调节与角质形成细胞增殖相关的生物因子。**第38页，共78页，星期日，2025年，2月5日3T3细胞滋养层培养法特点细胞接种密度低、增殖速度快且细胞生长稳定。3T3细胞逐渐被挤压,随着角质形成细胞集落不断扩大形成冠状,然后被压缩成条索状,最后脱落且消失。3T3细胞培养过程中会分泌异种蛋白和抗原,用它作为滋养层培养的人角质形成细胞或人工表皮,移植后可能引起异种排斥反应。培养过程中角质形成细胞角化明显。改进法：向培养基中加入表皮生长因子、能增加细胞内cAMP水平的试剂（霍乱毒素等）。**第39页，共78页，星期日，2025年，2月5日胶原滋养层培养法角质形成细胞的贴壁率玻璃培养瓶2.8%～7%,
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