第六章基因工程的基本技术.pptVIP

测序步骤①用M13噬菌体做载体获得单链DNA模板，克隆并扩增待测DNA片段，使其变性。②选择一条与DNA单链互补的短链引物，将引物用放射性同位素标记。③引物先同单链模板复性。④在四个反应管中分别加入待测DNA单链模板、互补引物分子、四种的dNTP、DNA聚合酶(Klenow酶)以及不同的ddNTP。⑤进行聚合反应，DNA新生链延长，当掺入ddNTP时，聚合反应终止。⑥在聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶中电泳。⑦根据X底片对凝胶曝光所显的条带位置，读出DNA序列。第62页，共90页，星期日，2025年，2月5日第63页，共90页，星期日，2025年，2月5日5ˊ32P-GTCATGTGCTAG5ˊ32PGTCATGTGCTA5ˊ32PGTCATGTGCT5ˊ32PGTCATGTGC5ˊ32PGTCATGTG5ˊ32PGTCATGT5ˊ32PGTCATG5ˊ32PGTCAT5ˊ32PGTCA5ˊ32PGTC5ˊ32PGT5ˊ32PG从下到上依次读出DNA片段的核苷酸序列第64页，共90页，星期日，2025年，2月5日新发展的DNA测序技术第65页，共90页，星期日，2025年，2月5日DNA自动测序仪的应用实现了凝胶电泳、初始数据获取、碱基阅读等步骤自动化。自动测序仪的设计原理是采用荧光标记DNA片段，并用激光激活的荧光探测系统，检测序列反应的分离产物，读出电泳条带所示的碱基顺序。分离产物有两种基本方法：单荧光标记四泳道分离和四荧光标记的单泳道分离。特点第66页，共90页，星期日，2025年，2月5日测序原理ABI公司（美国应用生物系统公司）发展的四标记单泳道法是用4种不同的荧光标记物标记4个反应的引物，4个反应在一个泳道中电泳分离。每个反应产物用不同颜色的荧光标记进行区分，再用计算机将经过荧光探头的不同颜色顺序转变成测序信息。这种同一泳道的分离避免了泳道间差异对测序的影响。第67页，共90页，星期日，2025年，2月5日ddGTPddATPddTTPddCTPKeytechniqueLabelingddNTPwith4kindofdRhodamineEachdRhodaminegivedifferentcolor第68页，共90页，星期日，2025年，2月5日2.测序步骤第69页，共90页，星期日，2025年，2月5日A:dNTP+ddATPG:dNTP+ddGTPC:dNTP+ddCTPT:dNTP+ddTTP第70页，共90页，星期日，2025年，2月5日第71页，共90页，星期日，2025年，2月5日计算机排序5ˊ第72页，共90页，星期日，2025年，2月5日第73页，共90页，星期日，2025年，2月5日StrategyforsequencingaDNAfragment1.Primerwalking2.Randomclones第74页，共90页，星期日，2025年，2月5日1.PrimerwalkingSynthesizingoligo-nucleotides一次测序反应一般可读出600～800bp，若待测序的DNA片断较大，则需从多处不同的位置引导测序反应。第75页，共90页，星期日，2025年，2月5日2.Randomclones对于更大的目标片段：一次测序反应一般可读出600～800bp，若待测序的DNA片断非常大，则可以将目标片段打断，然后进行随机克隆，构建能够覆盖其全长的文库，然后对这些文库进行测序，获得一系列打断的片段序列，最后通过拼接获得全长序列。第76页，共90页，星期日，2025年，2月5日第四节核酸杂交（印迹）技术第30页，共90页，星期日，2025年，2月5日本节内容印迹基本原理与过程DNA印迹（Southernblotting）RNA印迹（Northernblotting）斑点杂交原位杂交蛋白质/DNA、蛋白质/RNA杂交技术westernblotting（Pr）第31页，共90页，星期日，2025年，2月5日核酸分子杂交技术是在1968年由华盛顿卡内基学院（CavnegieInstituteofWashington）的RoyBritten及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。核酸分