过程中常见问题及处理方法【共36张优质】.pptVIP

过程中常见问题及处理方法过程中常见问题及处理方法c检测磷酸化抗体时，不能使用酪蛋白/脱脂奶粉作为封闭剂电极不平衡或者加样位置偏斜尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）封闭时使用温和的去污剂，如TWEEN20可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全——更换合适的封闭剂（脱脂奶粉，BSA，血清等）更换封闭剂（常用的脱脂奶、BSA、血清或明胶）目的蛋白的表达特性分析过程中常见问题及处理方法Westernblot结果曝光问题a洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景；可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移液浸泡20min；——增加洗涤次数，增加洗膜次数凝胶若是没在预冷的转膜buffer中浸泡，就会在转膜过程中出现凝胶皱缩，导致出现转移条带变形WB的简介WB即蛋白质印迹法（WesternBlot）。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。基本原理通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。应用1.目的蛋白的表达特性分析2.目的蛋白与其它蛋白的互作3.目的蛋白的组织定位4.目的蛋白的表达量分析a脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白标记的抗体一起使用，因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生物素——设置二抗对照(不加一抗),降低二抗浓度转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移液浸泡20min；c膜顺序：阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板，不能放反2、一抗或/和二抗浓度低它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。——更换合适的封闭剂（脱脂奶粉，BSA，血清等）凝胶若是没在预冷的转膜buffer中浸泡，就会在转膜过程中出现凝胶皱缩，导致出现转移条带变形目的蛋白的表达特性分析——增加洗涤次数，增加洗膜次数样品中含有不溶性颗粒目的蛋白的表达特性分析根据不同的蛋白大小，选择不同的浓度制胶。因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。c膜顺序：阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板，不能放反三、WB的影响因素步骤较多，任何一步都可能影响结果1、电泳分离蛋白蛋白抽提；蛋白定量；样品制备变性；上样量；电泳（电压、电流的大小，胶浓度、制胶）2、转膜膜的选择；膜的确认；特殊处理；……3、封闭封闭液的选择；封闭条件优化；……4、漂洗漂洗液的配制与选择漂洗时间及次数5、抗体孵育抗体及稀释液选择；抗体稀释倍数优化；抗体孵育时间；……6、曝光曝光时间的掌控四、注意事项1.蛋白样品的提取尽可能新鲜组织或蛋白避免反复冻融对于有些蛋白，加去磷酸化的（NaF）尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）选择合适的裂解液准确定量（BSA标准蛋白）a脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白标记的抗体一起使用，因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生物素d转膜过程产生大量的热，注意冷却封闭时使用温和的去污剂，如TWEEN20因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。增加抗体浓度；——更换合适的封闭剂（脱脂奶粉，BSA，血清等）a洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景；根据不同的蛋白大小，选择不同的浓度制胶。可通过设置内参可以验证二级测系统的有效性a洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景；玻璃板底部放平，尽量不能漏胶水或异丙醇压的时候，不能太久b如果封闭剂中含磷酸酶，用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋白受到影响，因为磷酸酶与印记膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化——增加洗涤次数，增加洗膜次数水或异丙醇压的时候，不能太久2、制胶根据不同的蛋白大小，选择不同的浓度制胶。制胶的时候一定要注意玻璃板一定要干净，不能有残留的胶。玻璃板底部放平，尽量不能漏胶灌胶的时候，不能太快，容易产生旋窝水或异丙醇压的时候，不能太久3、转膜a泡膜：转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移液浸泡20min；凝胶若是没在预冷的转膜buffer中浸泡，就会在转膜过程中出现凝胶皱缩，导致出现转移条带变形bPVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸