流式细胞检测技术讲座.pptVIP

FACSCanto光学滤片检测器组（激光器）PMT位置带通/长通透镜适用染料八角形（488nm蓝色激光）A780/60PE-Cy7B670LPPerCP-Cy5.5,PerCPC585/42PE,PID530/30FITC三角形（633nm红色激光）A780/60APC-Cy7B660/20APC第31页，共43页，星期日，2025年，2月5日FACSAria光学滤片检测器排列（激光器）光电倍增管BP滤光片可用染料八角形（488nm蓝色激光）A780/60PE-Cy7B695/40PerCP-Cy5.5,PerCPC610/20PE-TexasRedD575/26PEE530/30FITC三角形（633nm红色激光）A780/60APC-Cy7B660/20APC三角形（407nm紫色激光）A530/30AlexaFluor430B450/40CascadeBlue,PacificBlue,DAPI,Hoechst,AlexaFluor405第32页，共43页，星期日，2025年，2月5日第1页，共43页，星期日，2025年，2月5日主要内容流式细胞技术概念流式细胞技术原理流式实验的设计流式细胞技术在临床科研上的应用第2页，共43页，星期日，2025年，2月5日流式细胞技术概述流式细胞技术的概念流式细胞技术的特点流式细胞仪的检测范围BD公司流式细胞仪流式细胞仪的结构第3页，共43页，星期日，2025年，2月5日什么是FCM？流式细胞术：利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析及分选的技术激光技术+流体力学+光电测量技术+计算机技术+细胞荧光化学技术+单克隆抗体技术第4页，共43页，星期日，2025年，2月5日FCM的特点测量速度快：最快可在1秒种内检测上万个细胞可进行多参数测量：可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量具有明显的统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况高分辨率(CV2%)、高灵敏度(荧光检测灵敏度≤100MESF，前向角散射光检测灵敏度(0.2～0.5um)既是细胞分析技术，又是精确的分选技术，分选纯度可达99%以上第5页，共43页，星期日，2025年，2月5日流式细胞仪的检测范围细胞结构细胞大小细胞颗粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性激素结合位点细胞受体第6页，共43页，星期日，2025年，2月5日BD公司流式细胞仪FACSCaliburLSRIIFACSCantoFACSCountFACSVantageFACSAria第7页，共43页，星期日，2025年，2月5日流式细胞仪的结构光路：1、激光光源及光束成形系统：氩离子(488nm)红色氦氖激光(633nm)2、光学系统：透镜、滤光片、小孔液路——流动室及液流驱动系统（鞘流原理）信号检测与分析：光电倍增管(PMT)、补偿电路存储、显示、分析系统：计算机细胞分选系统第8页，共43页，星期日，2025年，2月5日流式细胞技术原理荧光发生机理及荧光光谱滤光片散射光信号的检测荧光信号的检测数据的储存与分析第9页，共43页，星期日，2025年，2月5日荧光及荧光发生机理简介荧光及荧光素：某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射光波长长的光线——即荧光。受激发后能产生荧光的物质称荧光物质或荧光素荧光发生机理：室温下荧光素分子大部分处于“基态”，当荧光素在一定波长（激发波长）的光的照射下吸收光能后（经染色后的细胞在激光束的照射下），荧光染料吸收能量能级跃迁，进入新的状态，称为“激发态”，处于激发态的分子不稳定，它可以通过在10-9～10-7秒的极短时间内以发射一定波长的光量子的方式释放所吸收的能量从而返回到基态。这一过程称为荧光发射，也就是发光。第10页，共43页，星期日，2025年，2月5日荧光素的激发和发射光谱任何发荧光的物质分子都具有这两个特征光谱激发光谱（Excitation，Ex）：是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线，也称为吸收光谱。吸收波峰（最大吸收波长）：Ex-Max发射光谱（Emission，Em）：是指某一波长激发光