《实验室诊断技术》课件——细菌的染色、生化鉴定及其他方法.pptVIP

3细菌分子生物学检测技术3.3DNA环介导恒温核酸扩增法原理：针对靶基因的特定区域设计1种特异的引物，利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNApolymcrasc)在65℃左右恒温保存几十分钟，即可完成核酸扩增反应，且1h内可扩增靶基因至1010倍。反应过程不会受到反应混合物的影响且受非靶序列DNA分子的影响较小。同时，在等温条件下扩增，不会因温度的改变而造成时间损失，并且模板也不需要进行热变性，从而保证了LAMP扩增的高效特异性。3细菌分子生物学检测技术3.3DNA环介导恒温核酸扩增法DNA环介导恒温核酸扩增法(LAMP)是一种连续、恒温、基于酶反应的，可用于细菌和病毒的定性检测的新型核酸扩增方法，具有高特异性和等温快速扩增的特点。例：志贺菌检测3细菌分子生物学检测技术3.4CRISPR检测近来研究发现成簇规律间隔的短回文重复序列(ClusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsCRISPR)广泛分布于细菌和古细菌中。CRISPR主要由重复序列(repeat)和间隔序列(spacer)间隔排列构成的R-S结构组成，其与CRISPR相关蛋白基因(CRIPSPRassociated，cas)组成CRISPR/cas系统，为原核生物提供对噬菌体、质粒等外源基因的获得性免疫能力，从而抵抗噬菌体感染，限制基因的水平转移(HGT)。3细菌分子生物学检测技术3.4CRISPR检测例：志贺菌CRISPR的检测3细菌分子生物学检测技术3.5DiversiLab系统DiversiLab系统是基于重复序列聚合酶链反应(rep-PCR)技术原理的半自动基因分型方法，通过PCR扩增细菌基因组的非编码重复序列后根据扩增片段的多态性比较菌株间相似性，其操作简单、可重复、数据标准化，可广泛应用于医院感染菌的快速检测分型。3细菌分子生物学检测技术3.5DiversiLab系统例：DivcrsiLab系统对医院感染的鲍曼不动杆菌进行同源性分析3细菌分子生物学检测技术3.6VNTR检测技术可变数串联重复序列(VariableNumberofTandemRepeat,VNTR)通常由二个核甘酸组成的单元如“胞嘧啶+腺嘌呤”(CA)经过若干次重复组成，由于重复的次数(即n值)是可变的，因而构成一种多态类型。VNTR是近年提出的概念，因其在基因组中分布极为丰富，故应用日趋广泛。就某一VNTR而言，通常重复单元可以表现出几次到几十次不同的重复，并由此决定不同的长度类型，因而其蕴含的多态信息量(PIC)较大。3细菌分子生物学检测技术3.6VNTR检测技术例：单核细胞增生性李斯特菌检测分型3细菌分子生物学检测技术3.6VNTR检测技术例：单核细胞增生性李斯特菌检测分型3细菌分子生物学检测技术3.7焦磷酸测序技术在细菌鉴定分型的分子生物学方法中，能够提供核酸碱基序列资料的分子检测技术成为细菌鉴定分型的金标准。焦磷酸测序技术是一种准确、快速、实时进行短片段DNA序列分析的方法，是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的技术。3细菌分子生物学检测技术3.7焦磷酸测序技术例：焦磷酸测序技术检测沙门氏菌4、其它血清学试验噬菌体分型生态特性氨基酸顺序蛋白质分析细胞壁等细胞成分通过原核生物的转化、转导、接合来判断原核生物的亲缘关系等等。****生化鉴定注意事项待检菌应是纯种培养物待检菌应是新鲜培养物遵守观察反应的时间必要的对照试验试验中至少挑取2-3各待检的疑似菌落分别进行试验。1.糖（醇、苷）类发酵试验原理：由于各种细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，故分解糖类的能力各不相同，细菌分解糖类后的终末产物亦不一致，有的产酸、产气，有的仅产酸，故可利用此特点以鉴别细菌。方法：将分离的纯种细菌，以无菌操作接种到糖（醇、苷）类发酵培养基中，置培养箱中培养数小时至两周后，观察结果。结果：若能分解培养基中的糖（醇、苷）类产酸时，培养基中的指示剂呈酸性反应。若产气可使液体培养基中倒管内或半固体培养基内出现气泡，固体培养基内有裂隙等现象。若不分解，培养基中除有细菌生长外，无任何其他变化。应用：是鉴定细菌最主要和最基本的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。大肠杆菌培养基变黄，小倒管内有气泡--产酸产气⊕伤寒杆菌培养基变黄，小倒管内无气泡--产酸不产气+空白葡萄糖发酵管