TCACM013—2016金银花快速PCR鉴定.docxVIP

目 次

前言 玉

范围 1

规范性引用文件 1

术语和定义 1

方案 2

仪器设备 2

试剂和溶液配制 2

检验程序 3

结果判定 4

结果报告 4

质量保证 4

废弃物处理 5

附录A 6

前言

前

言

T

T/CACM013—2016

本标准的全部技术内容为推荐性。

本标准是对《中华人民共和国药典》标准的补充。本标准由中华中医药学会归口。

本标准起草单位:中国中医科学院中药资源中心、国药种业有限公司。

本标准主要起草人:袁媛、黄璐琦、蒋超、赵玉洋、周骏辉、何雅莉、王继永。

请注意本标准的某些内容有可能涉及专利,本标准的发布机构不应承担识别这些专利的责任。

玉

PAGE

PAGE1

PAGE

PAGE10

金银花快速PCR鉴定

范围

本标准规定了使用快速PCR鉴定金银花药材和饮片、种子种苗的通用方法和要求。本标准适用于金银花药材和饮片、种子种苗鉴定。

规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。

《中华人民共和国药典》

GB/T6682《分析实验室用水规格和试验方法》

GB/T23632《进境植物检疫截获有害生物鉴定复核规程》GB/T27403《实验室质量控制规范食品分子生物学检测》GB/T3543郾1《农作物种子检验规程总则》

GB/T3543郾5《农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定》

术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1

送检样品testsample

按一定规则取自某一整体的一个或多个部分,并能反映该整体的相关信息,可以作为判断该整体

的基础。

3.2

3.3

3.4

DNA提取DNAextraction

从样品中提取出DNA的方法。

DNA扩增DNAamplification

通过一定技术使一段特定的DNA片段拷贝数增加的过程,可通过聚合酶链式反应扩增技术实现。

聚合酶链式反应polymerasechainreaction(PCR)

模板DNA先经高温变性为单链,两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列发生退

火,在DNA聚合酶的作用下,以四种脱氧核糖核酸(dNTP)为底物,使退火引物得以延伸,然后不断重复变性、退火和延伸这一循环,使位于两段已知序列之间的DNA片段拷贝数呈几何倍数增长。其扩增产物可通过多种特异性和敏感性好的方法进行检测。

3.5

阳性对照positivecontrol

一般使用对照样品代替送检样品同法DNA提取、靶核酸扩增和产物检测过程,用于证明鉴定过程可获得目标核酸片段的操作。

3.6

阴性对照negativecontrol

使用常见伪品药材代替送检样品同法DNA提取、靶核酸扩增和产物检测过程。

T

T/CACM013—2016

T

T/CACM013—2016

3.7

空白对照blankcontrol

以水代替送检样品同法DNA提取、靶核酸扩增和产物检测过程,用以证明提取过程中没有核酸

污染。

3.8

对照样品standardsample

对照样品包括对照药材和种子种苗对照样品。种子种苗对照样品是由中药材种子种苗标准起草单位提交,经全国中药材种子(种苗)标准化技术委员会认定并保存,与品种名称相符的种子种苗样品。

方案

金银花快速PCR鉴定应采用抽取有代表性的送检样品与对照样品比较的验证方式,即依据金银花特异性DNA位点差异,使用单核苷酸多态性标记法进行鉴定。利用碱裂解法提取金银花模板DNA,以提取的DNA为模板进行PCR扩增,荧光检测或琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

仪器设备

所有制备样品使用的器具在使用前应灭菌处理。

5.1PCR仪

使用前应进行温度校准。

5.2手持式紫外灯

可检测365nm紫外波长。

5.3连续可调微量移液枪

至少应该包括0.1~2.5滋L、0.5~10.0滋L、10~100滋L、100~1000滋L规格,并包括配套一次性吸头。

4保温设备

至少应包含4益与-20益温区。

试剂和溶液配制

除另有规定外,实验试剂为不含DNA和DNase的分析纯或生化试剂;实验用水符合GB/T6682的要求;所配制的试剂均应灭菌后保存,并在容器上注明试剂名称、浓度、配制时间、保存条件、失效日期和配