重组外切纤维素酶枯草杆菌的构建及其在醋糟发酵中的应用.docxVIP

重组外切纤维素酶枯草杆菌的构建及其在醋糟发酵中的应用

摘要

本研究旨在构建能够高效表达外切纤维素酶的重组枯草杆菌，并探索其在醋糟发酵中的应用潜力。通过基因工程技术，将外切纤维素酶基因导入枯草杆菌中，成功构建了重组菌株。对重组菌株的酶活性进行测定，并将其应用于醋糟发酵实验，分析发酵前后醋糟的成分变化以及发酵产物的特性。结果表明，重组枯草杆菌能够高效表达外切纤维素酶，显著提高醋糟的降解率，改善发酵产物的品质，为醋糟的资源化利用提供了新的技术途径。

关键词

重组枯草杆菌；外切纤维素酶；醋糟发酵；资源化利用

一、引言

醋糟是食醋酿造过程中产生的副产物，含有大量的纤维素、半纤维素等碳水化合物，同时还含有少量的蛋白质、脂肪和矿物质等成分。然而，由于醋糟的木质纤维素结构复杂，难以被微生物直接降解利用，导致其在农业和工业中的应用受到限制，大量醋糟的堆积不仅占用土地资源，还会对环境造成污染。因此，寻找有效的方法对醋糟进行处理和资源化利用具有重要的现实意义。

纤维素酶能够将纤维素分解为葡萄糖等可发酵性糖类，在生物质转化领域具有广泛的应用前景。外切纤维素酶是纤维素酶系中的重要组成部分，它能够从纤维素链的非还原端依次水解β-1,4-糖苷键，释放出纤维二糖或葡萄糖。枯草杆菌作为一种安全、高效的工业微生物，具有生长速度快、易于培养、分泌能力强等优点，是基因工程表达外源蛋白的理想宿主。本研究通过构建重组外切纤维素酶枯草杆菌，利用其高效表达的外切纤维素酶对醋糟进行发酵处理，以期实现醋糟的高效降解和资源化利用。

二、材料与方法

（一）材料

菌种与质粒：枯草杆菌野生型菌株、含有外切纤维素酶基因的表达质粒pET-cel（来自于某纤维素分解菌）。

培养基：LB培养基（用于枯草杆菌的培养）、发酵培养基（以醋糟为主要碳源，添加适量的氮源、无机盐等成分）。

试剂：限制性内切酶（EcoRI、HindIII等）、DNA连接酶、T4DNA聚合酶、琼脂糖、引物（根据外切纤维素酶基因序列设计，用于PCR扩增）、各种生化试剂（用于酶活性测定和成分分析）。

（二）方法

重组表达载体的构建

目的基因的扩增：以含有外切纤维素酶基因的质粒pET-cel为模板，利用设计的引物进行PCR扩增，获得外切纤维素酶基因片段。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min。

载体的酶切与连接：用限制性内切酶EcoRI和HindIII分别对扩增得到的外切纤维素酶基因片段和表达载体pET-28a进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，回收目的基因片段和载体片段。将回收的目的基因片段和载体片段用DNA连接酶进行连接，构建重组表达载体pET-28a-cel。

重组质粒的转化与鉴定：将重组表达载体pET-28a-cel转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含有卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆。提取阳性克隆的质粒，进行双酶切鉴定和测序验证，确保目的基因正确插入到载体中。

重组枯草杆菌的构建

感受态细胞的制备：将枯草杆菌野生型菌株接种到LB培养基中，37℃振荡培养至对数生长期，按照氯化钙法制备感受态细胞。

重组质粒的转化：将鉴定正确的重组质粒pET-28a-cel转化到枯草杆菌感受态细胞中，在含有卡那霉素的LB平板上筛选重组枯草杆菌菌株。

重组菌株的筛选与鉴定：挑取平板上的单菌落，接种到液体LB培养基中，37℃振荡培养，提取重组菌株的基因组DNA，利用PCR技术扩增外切纤维素酶基因，鉴定重组菌株。

重组枯草杆菌的培养与酶活性测定

重组菌株的培养：将重组枯草杆菌菌株接种到发酵培养基中，37℃、200r/min振荡培养，定时取样测定菌体生长量和酶活性。

酶活性测定：采用DNS法测定外切纤维素酶的活性。以羧甲基纤维素钠（CMC-Na）为底物，在一定条件下反应，生成的还原糖与DNS试剂反应，在540nm处测定吸光度，根据标准曲线计算酶活性。酶活性单位定义为：在一定条件下，每分钟催化产生1μmol还原糖所需的酶量为1个酶活力单位（U）。

醋糟发酵实验

醋糟的预处理：将新鲜的醋糟进行干燥、粉碎处理，过40目筛，备用。

发酵实验设计：设置对照组和实验组，对照组添加等量的枯草杆菌野生型菌株，实验组添加重组枯草杆菌菌株。每个处理设置3个重复。将处理后的醋糟按照一定的料水比（1:2，w/v）与发酵培养基混合，调节pH至7.0，121℃灭菌20min，冷却后接种菌株，接种量为5%（v/v），37℃厌氧发酵7天。

发酵产物的分析：发酵结束后，测定发酵产物的pH