第十四章电泳分离技术.pptVIP

主要试剂及相关问题：4、TEMED(四甲基乙二胺)通过催化过硫酸铵形成自由基，加速Acr-Bis聚合。低PH聚合反应受到抑制。5、过硫酸铵提供引发聚合反应的自由基。10%4℃保存.6、Tris-GlyBuffer吸入致命、挥发性强极其易燃，周围不得有明火！！！每周新配！！安全！第62页，共98页，星期日，2025年，2月5日凝胶浓度及其分离范围丙烯酰胺浓度线性分离范围/kDa1512107.55.010-4312-6020-8036-9457-212第63页，共98页，星期日，2025年，2月5日SDS电泳装置第64页，共98页，星期日，2025年，2月5日实验步骤安装玻璃板第65页，共98页，星期日，2025年，2月5日灌注分离胶加水膜约30min后，胶凝聚后用水清洗几遍！并吸干残存的液体第66页，共98页，星期日，2025年，2月5日灌注浓缩胶灌满！第67页，共98页，星期日，2025年，2月5日根据需要插入不同的梳子30min左右加电泳缓冲液，再拔梳子！第68页，共98页，星期日，2025年，2月5日拔梳子后形成点样孔孔周围有膜，用针拨开第69页，共98页，星期日，2025年，2月5日点样，电泳第70页，共98页，星期日，2025年，2月5日-+第71页，共98页，星期日，2025年，2月5日蛋白质电泳中SDS凝胶检测常采用的染色方法有:考马斯亮蓝、硝酸银染色、荧光染色法。第72页，共98页，星期日，2025年，2月5日染色液配制：0.1%考马斯亮蓝R250(先用甲醇充分溶解)50%甲醇10%冰乙酸40%蒸馏水滤纸过滤脱色液配制：10%甲醇10%冰乙酸80%蒸馏水5倍体积染色4小时以上，脱色摇床，中间更换几次脱色液第73页，共98页，星期日，2025年，2月5日硝酸银染色银染的机制:来源于摄影银染技术,是将蛋白分子结合的银离子还原作成金属银。优点:检测灵敏度高,较普通考马斯亮蓝染色灵敏度要高50-100倍,可在蛋白质中找到含量较低的蛋白,而且所需的上样量较少(每点仅需0.1ｎｇ)。缺点:可重复性差耗费人力质谱测定有一定的干扰第74页，共98页，星期日，2025年，2月5日第75页，共98页，星期日，2025年，2月5日在某一PH下，蛋白质分子在电场中不再移动，即静电荷为零，则此PH值即为该蛋白质的等电点。4、等电聚焦第76页，共98页，星期日，2025年，2月5日 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(IsoelectricFocusing，简称IEF)：利用各种蛋白质pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体(carrierampholytes)，两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。在电场作用下，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。第77页，共98页，星期日，2025年，2月5日PI2PI3PI1++-+++--+---PH增加+_蛋白质123蛋白质在电场中，等点聚焦示意图第78页，共98页，星期日，2025年，2月5日第79页，共98页，星期日，2025年，2月5日电泳系统中加进两性电解质载体，当通已直流电时，两性电解质载体即形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度。Pr进入时，不同的Pr移动到与其等电点相当的pH位置上，从而使不同等电点的Pr得以分离。优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，可测定Pr或多肽的等电点。缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性的Pr。第80页，共98页，星期日，2025年，2月5日第二向根据蛋白质的分子量大小不同在垂直方向或水平方向进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS)5、双向电泳第一向根据蛋白质的等电点不同在PH梯度胶中等点聚焦（isoelectricfocusing,IEF)第81页，共98页，星期日，2025年，2月5日聚丙烯酰胺凝胶构成聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵(AP)或核黄素(C17H2O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结