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引物设计
一.引物设计原则
首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳
定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点
聚合反应(即错配)。
二.引物设计注意的要点
1.引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，
因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq聚合酶进行
反应。
2.引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的
序列，否则容易导致错配。引物3’端出3现个以上的连续碱基，如
GGG或CCC，也会使错误机率增加。
3.引物3’端的末位碱基对Taq酶的合成效率有较大的影响。不同
的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错
配效率明显高于其他3个碱此应当避免在引物的3’端使用碱
基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’
端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
4.引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于反
应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
5.引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。
Tm值的计算有多种方法，如按Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在
Oligo软件中使用的是最邻近法(thenearestneighbormethod)。
Primerdesign
1.Principofprimer
design
First,thesequencesoftheprimersandthetemteshouldbecloselycomplementary.
Secondly,theformationofastabledimerorhairpinstructurweentheprimersis
avoided.Secondly,theprimerscannotinitiatepolymerizationreactionatnon-target
sitesofthetemte(i.e.,mismatch).
2.Keypointstopayattentionto
whendesigningprimers
1.Thelengthofprimersisgenerally15-30bp,and18-27bpiscommonlyused,butshould
notbegreaterthan38,becausetoolongwillcauseittensiontemperaturetobegreaterthan
74°C,whichisnotsuitableforTaqpolymerasereaction.
2.Theprimersequenceshouldnothavehighsimilarityinthetemte,especiallyinthe3’
end,asitmayeasilyleadtomismatch.Morethan3consecutivebasepearatthe3’endof
theprimer,suchas
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