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生物抗氧化测试技术全解析

引言

在生命活动的氧化还原平衡中，抗氧化物质扮演着至关重要的角色。它们通过清除过量的活性氧（ROS）、活性氮（RNS）或阻断其产生链条，从而保护生物大分子免受氧化损伤，维持细胞稳态。对生物样品（包括天然产物提取物、食品、药物乃至生物体液）抗氧化活性的准确评估，是功能食品研发、天然药物筛选、疾病机制研究等领域的核心环节。然而，氧化应激过程的复杂性以及抗氧化物质作用机制的多样性，使得抗氧化测试技术呈现出多方法、多层次的特点。本文旨在系统梳理当前主流的生物抗氧化测试技术，从体外化学模型到细胞乃至整体动物模型，剖析各类方法的原理、特点与适用范围，为相关研究人员提供一套相对完整的技术参考框架，以期在实际应用中能够科学选择、合理运用，从而获得更为客观可靠的实验数据。

一、体外化学抗氧化活性测定

体外化学抗氧化活性测定因其操作简便、快速高效、成本较低且易于标准化等特点，被广泛应用于抗氧化物质的初步筛选和活性评价。这类方法通常在离体条件下，利用特定的化学反应体系模拟氧化过程，通过检测抗氧化剂对特定氧化指标的影响来反映其活性。

1.1基于自由基清除能力的测定

自由基，尤其是氧自由基，是引发氧化应激的主要因素。清除自由基能力是衡量抗氧化活性最直接的指标之一。

1.1.1DPPH自由基清除法

DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）是一种稳定的有机氮自由基，在特定波长下有特征吸收。当遇到自由基清除剂时，其孤对电子被配对，吸收峰减弱或消失，吸光度的变化与清除能力呈线性关系。该方法操作简单，灵敏度较高，重复性好，是最常用的体外抗氧化筛选方法之一，适用于脂溶性和水溶性样品。然而，其反应机制可能涉及电子转移或氢原子转移，且部分样品可能与DPPH发生非自由基清除反应，导致结果偏差。

1.1.2ABTS自由基阳离子清除法

ABTS（2,2-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)）在氧化剂作用下可生成蓝绿色的ABTS+·自由基阳离子。抗氧化剂能够还原ABTS+·，使其颜色变浅，在特定波长下的吸光度降低。ABTS法的优势在于反应体系可溶于水和有机溶剂，适用性广，且反应速度快，可用于连续监测。与DPPH法类似，其结果也受到反应时间、pH值等因素影响。

1.1.3超氧阴离子自由基清除法

超氧阴离子自由基（O2·-）是生物体内最早产生的ROS之一。其清除能力的测定方法有多种，如邻苯三酚自氧化法（Pyrogallolautoxidationmethod）和黄嘌呤氧化酶-细胞色素c法等。邻苯三酚在碱性条件下会自氧化产生O2·-，并伴随特征性的吸光度变化，抗氧化剂可抑制这一自氧化过程。该方法成本较低，但易受pH、温度及金属离子干扰。

1.1.4羟自由基清除法

羟自由基（·OH）是生物体内活性最强的ROS，对机体损伤严重。测定其清除能力的方法包括水杨酸法、脱氧核糖法等。水杨酸法利用·OH与水杨酸反应生成有色产物，抗氧化剂清除·OH后会使产物生成量减少。该方法能较好地模拟·OH的产生和清除过程，但需注意控制·OH的产生效率和检测产物的稳定性。

1.2基于还原能力的测定

抗氧化剂大多具有还原能力，能将氧化态的金属离子还原，通过检测还原产物的生成量或反应体系的颜色变化来评价抗氧化活性。

1.2.1铁离子还原抗氧化能力测定法（FRAP法）

FRAP法基于在酸性条件下，抗氧化剂可将Fe3+-TPTZ（2,4,6-三吡啶基三嗪）复合物还原为蓝色的Fe2+-TPTZ复合物，其在特定波长下的吸光度与样品的还原能力成正比。该方法操作简便、快速，重现性好，灵敏度高，但反应依赖于酸性环境，可能无法完全反映生理条件下的抗氧化行为，且对某些含巯基的化合物响应较低。

1.2.2铁氰化钾还原法（Prussianblue法）

在碱性条件下，抗氧化剂可将铁氰化钾（K3[Fe(CN)6]）还原为亚铁氰化钾（K4[Fe(CN)6]），后者与Fe3+反应生成普鲁士蓝，通过测定其在特定波长的吸光度来评估还原能力。该方法经典简单，但反应时间较长，且易受其他还原性物质干扰。

1.3基于金属离子螯合能力的测定

金属离子（如Fe2+、Cu2+）是Fenton反应和Haber-Weiss反应的催化剂，能促进·OH等ROS的生成。抗氧化剂通过螯合这些金属离子，可抑制ROS的产生。常用的方法有邻菲罗啉法、二硫腙法等，通过检测螯合剂存在时金属离子与指示剂形成络合物的能力变化来评价螯合活性。

1.4基于抑制脂质过氧化的测定

脂质过氧化是ROS攻击生物膜脂质的结果，会导致膜结构和功能的破坏。硫代巴比妥酸反应物（TBARS）法是测定脂质过氧化程度的经典方法。该方法利用脂质过氧化终产物丙二醛（MDA）与硫代巴比妥酸（TBA）在酸性加热条件下生成有色复合物，通过比色法测定MDA含量，从而