医学细胞生物学细胞生物学研究方法.pptVIP

醫學細胞生物學;細胞生物學研究措施

;學習目的與规定;第一節顯微鏡技術;(一)一般光學顯微鏡的解析度

1.解析度（resolution，R）

顯微鏡或人眼在25cm的明視距離處，能辨别被檢物體微細結構最小間隔的能力。人眼極限100?m，光學顯微鏡極限200nm。;(一)一般光學顯微鏡的解析度;3.組織切片製備過程

⑴固定（fixation）使大分子交聯而保持在原有的位置上，防止結構移位或資訊丟失。

常用的固定劑：戊二醛、甲醛

⑵包埋（embedding）使組織形

成硬塊，便於切片。

常用的包埋劑：石蠟、樹脂;3.組織切片製備過程

⑶切片（section）切片厚度為1～10?m。

⑷染色（staining）增大反差。;組織切片製備過程;宮頸鱗癌組織切片;(二)相差顯微鏡一般被用於觀察活細胞;相差顯微鏡（phasecontrastmicroscope）：运用光的衍射和干涉效應把透過標本不一样區域的光波的光程差變成振幅差，使活細胞內各種結構之間呈現清晰可見的明暗對比。;相差顯微鏡觀察培養中的HeLa細胞;原理：散射光成像。

應用：解析度不高。

適合觀察活細胞內的細胞核、線粒體、液體介質中的細菌和真菌等。;暗視野顯微鏡觀察血液紅細胞;;(四)螢光顯微鏡可以呈現強反差的彩色圖像

1.螢光和螢光染料

⑴螢光

螢光分子可以在吸取特定波長的光後，發射出更長波長的可見光，稱為螢光。前者稱為激發光(excitationlight)，後者稱為發射光(emissionlight)。

⑵螢光染料

由於螢光分子可以使被檢樣品呈現不一样的染色，因此也稱螢光染料。;常見螢光分子的激發光與發射光波長範圍;;(五)共聚焦鐳射掃描顯微鏡可以提供高清晰的彩色

三維圖像;共聚焦鐳射顯微鏡工作原理示意圖;共聚焦鐳射顯微鏡下的血管內皮細胞微絲的分佈;(六)共聚焦鐳射掃描顯微鏡可以提供高清晰的彩色

三維圖像;共聚焦鐳射顯微鏡獲得被檢物體三維結構的原理及呈現的三維圖像;以電子束作光源，波長短，解析度高。

電子顯微鏡解析度

理論值：0.002nm

實際值：0.1nm

生物樣品：2nm

電鏡下觀察到的結構稱為超微結構。;(一)透射電子顯微鏡（transmissionelectronmicroscope，TEM）;透射電子顯微鏡標本製備過程：

⑴固定：雙重固定——鋨酸固定脂類，戊二醛固定蛋白。

⑵脫水：含水標本干擾觀察(50%-100%乙醇)。

⑶包埋：環氧樹脂是常用包埋劑。;透射電子顯微鏡標本製備過程

⑷切片：電子的穿透力有限，需製作超薄切片，厚度一般為50~100nm。

⑸染色：生物分子散射電子能力弱，需通過重金屬染色，增大反差，常用鋨、鈾、鉛等重金屬的鹽類。;(二)掃描電子顯微鏡（scanningelectronmicroscope，SEM）;掃描電鏡的工作原理;掃描電鏡觀察的有絲分裂中期染色體形態

（中國醫科大學宋今丹提供）;(三)透射電子顯微鏡借助金屬投影、冰凍斷裂及冰凍蝕刻技術可獲取三維圖像;;冰凍斷裂和冰凍蝕刻;葉綠體內膜冰凍斷裂複形，顯示內膜上存在大量膜蛋白;冰凍蝕刻顯示昆蟲肌肉細胞中的蛋白纖維;三、納米顯微技術;1.掃描隧道顯微鏡（scanningtunnelingmicroscope,STM）;1.掃描隧道顯微鏡（scanningtunnelingmicroscope,STM）;2.原子力顯微鏡（atomicforcemicroscope，AFM）

原理：通過分析探針針尖與樣品之間的原子間作用力來獲取所

觀察表面的微觀資訊。

特點：可以在三態（固態、氣態和液態）狀況下工作。

應用：活細胞表面及生物大分子空間伸展及其結晶體表面觀測

進行單個分子操作。;2.原子力顯微鏡（atomicforcemicroscope，AFM）;原子力顯微鏡觀察細胞膜表面，顯示兩種分子大小不一样的膜脂參與了此細胞膜的組成。

原子力顯微鏡測定大分子間的作用力。左圖中DNA分子固定在支持物上，原子力顯微鏡的探針吸附了與DNA分子結合的蛋白。;四、超辨别光學顯微技術;四、超辨别光學顯微技術;受激發射損耗顯微技術成像與共焦顯微技術成像比較;第二節細胞的分離和培養;一、不一样類型細胞的分離;流式細胞儀（flowcytometer）：從多細胞懸

液中分離目的細胞的精密儀器。

樣品處理：用帶有螢光的特異抗體標記待分離

的細胞。

分離速度：2萬個細胞/s。

分離純度：＞95%。;(二