分生1012功能蛋白质组学研究方法.pptxVIP

功效蛋白质组学;功效蛋白质组学是指对蛋白质间、蛋白质与DNA/RNA间的互相作用的研究。以细胞内与某个功效有关或某种条件下的一群蛋白质为重要研究内容，由此建立细胞内外信号传递的复杂网络。;蛋白质芯片技术

噬菌体展示技术

酵母双杂交系统

;蛋白质芯片;蛋白质芯片反映成果的检测

荧光标记是芯片息采集中使用最多也是最成功的报告标志。对杂交反后的芯片上各个反映点的荧光位置、荧光强弱通过芯片扫描仪和有关软件进行分析，将荧光信号转成数据，即可获得有关生物信息。;蛋白质芯片分类;;SELDI-TOF-MS蛋白质芯片;ＳＥＬＤＩ技术的基本原理:

将待测样品滴到芯片表面(血清、尿液、分泌液、细胞裂解液等)，通过亲合作用样品中的某些蛋白质被吸附到芯片的固相基质表面上，用缓冲液洗去芯片上的杂质蛋白和其它污染物，然后在芯片上加入能量吸取分子（energyabsorbingmolecular,EAM），芯片干燥后，在真空管中用激光轰击，蛋白质在吸取能量后被解析发生离子化，在电场力作用下脱离芯片表面，被离子检测器所检测。检测成果通过软件分析解决后，可绘制出质谱图，显示有关蛋白质的分子量、含量等信息。;抗体芯片;靶蛋白质芯片;液相蛋白质芯片

;噬菌体展示技术;这一技术有效地实现了基因型和表型的体外转换，即在两者之间架起了桥梁，使得研究者完全能够在分子克隆的基础上，有效地实现蛋白质构象的体外控制，从而能够在体外获得含有良好生物学活性的体现产物。;Navagen公司用T7噬菌体构建的多个cDNA体现文库，将外源基因序列插入到编码T7噬菌体外壳蛋白基因中，插入片段基因长度可在300bp～3000bp之间，所体现的多肽或蛋白质以与噬菌体外壳蛋白融合的形式展示在噬菌体表面。

T7噬菌体展示文库能够展示相称部分体现的蛋白质，甚至能够保持蛋白的一定构象。因此，该系统最大程度地再现了细胞内的真实状况，所筛选出的结合蛋白与自然状态较为靠近。现在已被成功应用于蛋白质-蛋白质、抗原-抗体以及DNA-蛋白质之间作用的研究，为功效基因组学的研究提供了一种新的办法。;cDNA库是在噬菌体衣壳蛋白的基因中插入从某些组织或细胞中抽提出来的mRNA的互补DNA片段，从而体现该组织或细胞的多个蛋白于噬菌体的表面。

如：抗体库的构建;体现载体噬菌粒pCANTAB5E;噬菌体展示技术的应用;2.在筛选和制备多肽药品方面的研究及应用

随机噬菌体展示多肽文库：一组随机编码序列或基因群插入噬菌体载体进行体现及展示时,就形成噬菌体展示文库，在文库中,每个噬菌体粒子只展示一种序列的外源肽链,不同噬菌体粒子展示不同序列的外源肽链。用一定功效的靶分子筛选，能够简便快速地获得与靶分子含有强亲和力和特异性的小肽或新型蛋白，这些肽段能够作为侯选药品进行开发。;3在疾病的治疗和致病机理方面的研究

有研究以HCV非构造蛋白NS4A作为固相靶分子，用T7噬菌体表面展示的人肝细胞cDNA文库进行5轮筛选后，拟定了与HCV非构造蛋白NS4A结合的是肝细胞蛋白丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）激活蛋白激酶5（MAPKAPK5），为进一步研究HCV的致病机制奠定了基础。;酵母双杂交系统

;DNA-BD能够识别GAL4效应基因的上游激活序列(Upstreamactivatingsequence,UAS),并与之结合，而AD则通过与转录机制中的其它成分之间的作用,启动UAS下游的基因进行转录。DNA-BD和AD单独作用均不能激活转录反映,只有当两者在空间上充足靠近并呈现完整的GAL4转录因子活性时,方可激活UAS下游启动。;该系统中转录激活的条件是蛋白质作为一种整体起作用。

分别经分子克隆技术在同一细胞中体现的BD和AD多肽不会彼此间发生作用，BD和AD分别能够同其它蛋白质X或Y结合形成融合蛋白,如果X，Y之间能够形成蛋白-蛋白复合物,使GAL4两个构造域重新构成AD和BD成为一体,就能够启动特异基因序列的转录。;GAL4重建后激活转录模式图;普通地,将BD-X的融合蛋白称作诱饵(bait),X往往是已知蛋白,AD-Y称作猎物(prey),能显示诱饵和猎物互相作用的基因称报告基因,通过对报告基因的检测,反过来可判断诱饵和猎物之间与否存在互相作用。;作为一种分析蛋白质与蛋白质之间互相作用的简便而有效的研究体系,酵母双杂交的最大的优点是不需要分离、纯化蛋白质,整个过程只是对核酸进行操作。;酵母双杂交系统应用

;酵母双杂交系统的局限性;2.易发生假阳性

假阳性分为两类：

一类是生物学上的假阳性

即蛋白质与蛋白质的互相作用在酵母细胞中发生,但是在其生物体细胞内并不发生互相作用，这重要是由于两种蛋白不同时体现或者两