中国计量大学《仪器分析》课件-第7章分子发光法.pptVIP

*****************************************原理自由DNA与DNA-蛋白质复合物在电泳移动过程中迁移速度不同靶DNA探针上末端标记生物素，与HRP上标记的亲和素结合，化学发光底物与HRP反应X光片呈现位置滞后检测出DNA－蛋白质是否有相互作用*等同于同位素的灵敏度,同样曝光时间,是地高辛灵敏度的8倍*极高的信噪比和极短的曝光时间*生物发光分析应用1在pH7～8；荧光素酶(E)和Mg2+的存在下，荧光素(LH2)与磷酸三腺甙(ATP)的反应，生成磷酸腺甙(AMP)荧光素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐(ppi)：ATP+LH2+E+Mg2+????AMP·LH2·E+Mgppi+2H+pH7-8复合物与氧反应，产生化学发光：AMP·LH2·E+O2???[氧化荧光素]*+AMP+CO2+H2O[氧化荧光素]*???氧化荧光素+h?最大发射波长562nm；*生物发光分析应用2烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在细菌荧光虫素酶作用下，在氧化型黄素单核苷酸(FMA)存在下，发生发光反应，可以灵敏、精确地测定NADH：NADH+FMA+H+??????NAD++FMNH2NADH脱氢酶FMNH2+RCHO+O2??——??FMN+RCOOH+H2O+h?细菌荧光虫素酶最大发射波长495nm；*二、特点1.灵敏度极高例：荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化学发光分析，可测定2?10-17。Mol/L的ATP，即可检测出一个细菌中的ATP含量。2.仪器设备简单不需要光源、单色器和背景校正；3.发射光强度测量无干扰无背景光、散射光等干扰；4.线性范围宽5.分析速度快缺点：可供发光用的试剂少；发光反应效率低；机理研究少。***FluorescentbindingassayusingASA.(A)Fluorescenceemissionspectrarecordedat25℃.1μMASAinpresenceof1μMrecombinantASP3c;fluorescenceofASAalone(1μM);proteinsolutionalone(1μM).Wavelength:360nm(B)TitrationcurvesofASP3cwithASA;experimentaldata,isthecomputedbindingcurveFunctionofChemosensoryprotein*流式细胞仪

分选系统488nmlaser+-充电偏转板ChargedPlates单细胞收集SinglecellssortedintotesttubesFALSSensor荧光检测器Fluorescencedetector*laserconfocalscanningmicroscope,LCSM**人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交FluorescenceInSituHybridization(FISH)*扩增曲线熔解曲线Real-timePCR*******************3）取代基的位置：对位，邻位增强荧光，间位抑制荧光。反式二苯乙烯强荧光物质空间位阻?F=0.75?F=0.03立体异构体顺式二苯乙烯非荧光物质*(4)跃迁类型：?*→?的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。★强荧光的有机化合物具备下特征:①具有大的共轭?键结构；②具有刚性的平面结构；③具有最低的单重电子激发态S1为?*→?型；④取代基团为给电子取代基。*（1）.荧光猝灭※荧光分子与溶剂或其他物质分子作用使荧光强度减弱的现象称为荧光猝灭，能使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂。※荧光猝灭的主要原因是：①自猝灭：发光之前与其它基态碰撞引起猝灭，或生成不发荧光的基态多聚体，或因自吸导致荧光强度减