基于工程化T7噬菌体的非洲猪瘟病毒样颗粒构建及免疫效力评价.pdfVIP

摘要

非洲猪瘟（Africanswinefever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（AfricanSwinefever

virus，ASFV）感染家猪和野猪后所导致的一种急性、出血性烈性传染病，给全

球养猪业带来了巨大损失，目前仍缺乏有效的疫苗及现场快检制剂用于非洲猪瘟

的防控。研发安全、有效的非洲猪瘟疫苗、强化病原现场快速检测手段在非洲猪

瘟病毒感染防控中有重要意义。本研究在非洲猪瘟病毒免疫原分析的基础上，通

过构建ASFV抗原蛋白的多聚颗粒化病毒样粒子，以强化ASFV的免疫原性，为

ASFV的现场诊断、疫苗防控提供新手段。论文通过构建表达SpyTag的工程化

T7噬菌体，原核表达C端融合Spycatcher的ASFVp72、p30、P54、CD2v、K145R

蛋白，利用异肽键原理，成功制备了5种ASFV的病毒样颗粒（VLP），并对其

形态学、抗逆性、稳定性、免疫原性等生物学特征进行了表征。课题的主要研究

结果如下：

1.衣壳融合SpyTag（ST）T7-ST工程化噬菌体的构建：设计通过低温退火

反向互补配对、可正确整合至T7噬菌体载体的SpyTag引物序列，将退火产物

与T7噬菌体基因组片段酶连，进行噬菌体包装及E.coli宿主菌转染，构建了表

面展示SpyTag的T7-ST噬菌体；通过重组噬菌体噬斑纯化、库容与重组率检测，

获得了得率为1012-14/mL、表面展示SpyTag的T7-ST工程化噬菌体；透射电镜

（TEM）、原子力显微镜（AFM）对粒径大小与形貌进行了表征，获得了结构稳

定，粒径为70nm的工程化T7-ST噬菌体。

2.ASFV免疫原蛋白原核、真核表达载体的构建与蛋白纯化：（1）设计构建

了C端融合Spycatcher（SC）标签的ASFV抗原-SC融合蛋白。分别将优化设计

的ASFV免疫原基因片段经无缝克隆技术插入pET-28a原核表达载体，构建了

pET-28a-p30-SC、pET-28a-p54-SC、pET-28a-p72-SC、pET-28a-CD2v-SC、pET-28a-

K145R-SC表达质粒；相关表达质粒转化Rosetta感受态细胞，经诱导表达、亲和

层析等获得纯化的ASFV抗原-SC融合蛋白。（2）分泌型酿酒酵母真核表达载体

构建：利用实验室现有的分泌性酿酒酵母菌株、转录单位及同源臂，通过无缝克

隆技术，构建了五种分泌型酿酒酵母表达重组质粒：pGPD-xyn2s-p30-ADH1-POT、

pGPD-xyn2s-p54-ADH1-POT、pGPD-xyn2s-p72-ADH1-POT、pGPD-xyn2s-CD2v-

ADH1-POT、pGPD-xyn2s-K145R-ADH1-POT；通过构建转录单位、酵母转化获

得表达ASFV抗原-SC融合蛋白的分泌型重组酿酒酵母菌株，并验证了其表达。

3.不同ASFV病毒样颗粒（VLP）的构建及生物学特性表征：（1）5种ASFV

VLPs的制备及表征：将过量的大肠杆菌原核表达系统表达纯化的p30-SC、p54-

SC、p72-SC、CD2v-SC、K145R-SC融合蛋白溶液，分别与T7-ST工程化噬菌体

共同孵育，得到表面展示以上五种融合蛋白的T7噬菌体病毒样颗粒，通过TEM、

AFM对VLPs的分子量、粒径、形貌进行了表征；SDS、WesternBlotting

检测了异肽键结合能力及噬菌体新融合蛋白的形成情况；进一步确立了ASFV

VLP制备、纯化的条件参数；重组噬菌体的细菌感染实验评估了结合抗原之后噬

菌体的感染力和抗逆性。结果表明，5种重构的ASFVVLPs的形态大小依次为

K145R-T7CD2v-T7p30-T7p72-T7p54-T7；检测到了符合预期大小的异肽键

融合蛋白；重构后的噬菌体仍有感染细菌的能力，但其感染力下降了约1000—

10000倍。（2）VLPs的免疫效力评价：VLPs皮下注射免疫小鼠和家兔，通过重

组ASFV抗原包被、间接ELISA检测了相应ASFVVLP抗原特异性抗体滴度，

5

结果表明ASFVVLPs在小鼠和兔子体内诱导的特异性ELISA抗体效价高于1