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哺乳动物瞬时蛋白表达|CHO细胞蛋白表达|HEK293细胞蛋白表达

哺乳动物瞬时蛋白表达（TransientGeneExpression,TGE）是通过将目标基因导入哺乳动物细胞，实现短时期内重组蛋白表达的方法。相比于稳定表达系统，TGE省略克隆筛选等冗长步骤，具备快速、高效的优点，尤其适用于早期药物研发、抗体表达、新型抗原生产等应用场景。

常用的宿主细胞包括HEK293细胞系列（如293T、293F）和CHO细胞系列（如CHO-S、DG44等），这些细胞兼具人源化的蛋白翻译后修饰能力与规模化培养潜力。

哺乳动物瞬时表达系统组成

1.宿主细胞系

HEK293系列细胞蛋白表达系统：如HEK293E、293T、293F等，该细胞易于转染、增殖快、可适应无血清悬浮培养体系，转染效率高。

CHO系列细胞蛋白表达系统：多种亚型可供选择，适合大规模生产，安全性高，蛋白翻译后修饰质量较好。

2.表达载体与调控元素

表达载体是TGE的核心，通常包含启动子、增强子、转录终止信号及选择标记等元素。常用的CMV启动子在多种系统中被广泛采用；进一步的优化如加入EBNA-1/largeTantigen可促进TGE效率。

最新研究中，某些新型载体将CMV增强子、WPRE(woodchuckhepatitisviruspost-transcriptionalregulatoryelement)与EF-1α启动子组合使用，显著提升蛋白表达水平；实验显示，新构建载体表达GFP的效率比传统CMV载体高约27倍。

3.转染方法与试剂

在TGE中，非病毒转染方法被广泛采用，其中聚乙烯亚胺（PEI）因价格低廉和操作简便而成为首选。脂质体试剂也能提供较高的转染效率，但成本相对较高。对于难以转染的细胞，电穿孔和其他物理方法可以作为补充。在一些特定情况下，病毒载体（如腺病毒、杆状病毒）也被用于辅助转染，以提高转染效率和基因导入量。

4.细胞培养与培养条件

悬浮培养：如Expi293/ExpiCHO系列在高密度悬浮培养中表现优异，可实现较高产量。

温度调控：适度降低培养温度可提高表达效率及蛋白质量。

大规模培养：采用波浪式生物反应器（WAVEBioreactor）可实现在几十至数百升级别的大规模表达。

哺乳动物细胞瞬时表达优化策略与技术进展

1.启动子与调控元件优化

启动子是影响瞬时表达效率的关键因素。传统的CMV启动子在多数哺乳细胞中表现稳定，但近年来研究显示，复合型启动子能够显著提高表达水平。例如，CMV启动子与EF-1α启动子的组合，在多种细胞系中都表现出更高的转录活性。加入增强子和转录后调控元件（如WPRE）可进一步提高mRNA的稳定性和翻译效率，使目标蛋白的表达量增加数倍甚至数十倍。

2.蛋白分泌信号与融合标签设计

对于分泌型蛋白，信号肽的选择会显著影响分泌效率和最终产量。研究者对不同信号肽进行比较，发现一些优化信号肽能够在CHO和HEK293系统中显著提高分泌蛋白的水平。此外，添加融合标签（如Fc片段、His标签）不仅能增强蛋白稳定性，还能简化纯化过程，从而缩短生产周期。

3.细胞系工程改造

利用CRISPR/Cas9工具敲除凋亡相关基因（如Apaf1），可显著提高CHO细胞在转染后的存活率与表达量。

QMCF技术：通过EBNA-1与largeTantigen维持质粒的表观遗传复制，使表达期延长至数周并实现更高产量，适合中试工程。

4.病毒载体辅助系统

非整合型病毒载体也被用于瞬时表达。BacMam系统利用杆状病毒作为载体，可以高效将基因导入哺乳动物细胞，并实现较高水平的瞬时表达。该系统具有对多种细胞类型高度兼容的特点，并能够实现多基因同时表达，适用于复杂蛋白或多亚基复合物的研究。

5.转染工艺和培养流程优化

转染时的DNA/试剂比例、细胞密度、培养基成分等因素均会影响表达效率。通过优化这些工艺参数，可以显著提高产量并改善细胞状态。高密度培养系统（如Expi293和ExpiCHO）配合定制培养基，已被证明能在短时间内获得克级别的重组蛋白。这些工艺进展大大提高了瞬时表达的应用价值，使其在早期研发和中试阶段更加可靠。

哺乳动物瞬时蛋白表达作为快速、灵活、安全的重组蛋白生产方式，在生物医药研发与生产领域占据重要地位。通过载体优化、细胞工程改造、工艺流程改善，TGE将持续在产量与质量上取得突破，并在科研和产业化中展现更大潜力。