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第三章细胞生物学研究方法

Cell第一类研究方法第二类研究方法第三类研究方法V第四类研究方法

第一节细胞形态结构观察技术（一）普通复式光学显微镜一、光学显微镜技术

1.普通光镜的结构:光学放大系统：目镜和物镜照明系统：光源、折光镜和聚光镜机械和支架系统：保证光学系统的准确配置和灵活调控。目镜物镜集光器载物台光源

分辨率：指能区分开两个质点间的最小距离。其中λ为入射光线波长；N为介质折射率；α=镜口角（样品对物镜镜口的张角）；N．sinα/2为镜口率。对任何显微镜来说，最重要的性能参数是分辨率。D=0.61λ/N．sinα/2思考：如何提高显微镜的分辨能力？放大倍数=显微镜的分辨率人肉眼的分辨率

几种介质的折射率

显微镜的几个光学特点：制作光学镜头用的是玻璃，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。sinα/2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。空气中最短的可见光波长为450nm，镜口角最大值为140o，分辨率约0.3μm，若为油镜，D为0.2μm；肉眼的分辨力为0.2mm,因此显微镜的最大放大倍数为1000X。D=0.61λ/N．sinα/2

普通光学显微镜制片技术往往将标本固定－包埋－切片－染色——提高可辨程度。移动臂蜡或树脂包埋的样品切片用钢刀样品切片蜡带伸展在盖玻片和载玻片之间的切片切片机

（二）特殊光学显微镜logo1.荧光显微镜荧光显微镜技术包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术。

分裂细胞的免疫荧光图像不同荧光染料标记抗体特异性结合免疫荧光技术抗原(细胞的蛋白质成分)

用荧光素直接标记细胞中的某一蛋白，在荧光显微镜下就可以直接观察该蛋白的动态变化；01使用两种以上的荧光素标记同一样品，标记荧光素的样品在荧光显微镜下经不同波长的激发光激发可发射出不同颜色的荧光。02荧光素直接标记技术

诺贝尔化学奖:神奇的荧光蛋白美国华裔：钱永健日本：下村修美国：马丁.沙尔菲

2006年，我国首例绿色荧光蛋白转基因克隆猪在东北农业大学的种猪场自然分娩产出，这标志着我国在转基因克隆猪技术领域已达到世界领先水平。

激光共焦点扫描显微镜的原理图激光共焦点扫描显微镜(LaserConfocalMicroscope,LCM)

Q550MW型LCM优点：排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率倍)。

利用光切片技术显示的花粉内部结构

3.相差显微镜No.1(phasecontrastmicroscope)No.2原理：光通过不同密度物质时滞留的时间不同，利用相位差，将厚度的差别转化成明暗的差别，增加反差，可用于观察活细胞。

电子显微镜技术

一、电镜基本知识：0.61λD=——————N·Sinα/2λ：波长N：介质折射率α：物镜镜口角（标本在光轴的一点对物镜镜口的张角）放大倍数=显微镜的分辨率人肉眼的分辨率分辨率(resolution)是指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力，通常是用相邻两点间的距离来表示，可通过公式换算出：

各种光及电子束的波长Vλμ1

Ruska(1933~1938)便选择了电子束为光源来突破光学显微镜分辨率的极限，发明了透射电子显微镜(transmissionelectronmicroscope,TEM)。

电子显微镜与光镜的比较：电磁透镜高真空荧光屏电子枪

电子显微镜与光镜的主要区别显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理LMEM200nm0.1nm可见光（400-700）电子束（0.01-0.9）玻璃透镜电磁透镜不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差

由于电子束不能透过玻璃，因此用于电镜的标本须制成厚度仅有0.05?m的超薄切片，并放在铜网上。这种切片需要用超薄切片机制作。1.超薄切片技术二、主要电镜制作技术：超薄切片铜网

1.超薄切片技术固定?包埋?切片?染色01锇酸或戊二醛02环氧树脂03（重金属盐)04（40-50nm)05

2.负染色技术用重金属盐对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸出处则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。用磷钨酸钾染色（a）和铬镀膜后(b)的烟草rattle病毒电子显微图

3.冰冻蚀刻技术①将标本于-100℃干冰中或-196℃液氮中，超低温冰冻。②然后用冷刀骤然将标本冲断开，升温后冰在真空条件下迅即升华，暴露出了断裂面结构－蚀刻(etching)。蚀刻断裂冰