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医院抗菌药物敏感性试验标准操作

抗菌药物敏感性试验（AntimicrobialSusceptibilityTesting,AST）是临床微生物实验室的核心任务之一，其结果直接指导临床医师选择针对性的抗菌药物，优化治疗方案，同时对于监测细菌耐药性变迁、控制耐药菌株传播以及评估新抗菌药物的临床价值具有不可替代的作用。建立并严格执行标准化的AST操作流程，是保证试验结果准确性、可靠性和可比性的前提，更是实现精准医疗与有效感染控制的基石。本文旨在阐述医院AST的标准操作规范，以期为临床微生物实验室提供实践指导。

一、实验室要求与人员资质

AST的质量始于实验室的规范化建设和人员的专业素养。实验室应具备符合生物安全要求的操作环境，配备必要的仪器设备，如生物安全柜、孵育箱、比浊仪、自动化药敏仪（如适用）等，并定期进行维护和校准。试剂的选择至关重要，应优先选用经国家药品监督管理部门批准、性能验证合格的商品化试剂，包括各类培养基、抗菌药物纸片或稀释板、质控菌株等。所有试剂均需在有效期内储存和使用，并严格遵循制造商的说明。

从事AST操作的技术人员必须具备扎实的微生物学理论基础和熟练的操作技能。实验室应建立完善的人员培训、考核与授权制度。技术人员需定期接受AST相关知识和技能的培训，熟悉最新的标准操作程序（SOP）及判读标准（如CLSI或EUCAST标准），并通过考核后方可独立上岗。持续的继续教育和能力验证，是确保人员技术水平稳定提升的关键。

二、标准操作流程

（一）菌株的分离与纯化

AST的前提是获得纯培养的病原菌。临床标本（如血液、痰液、尿液、脓液等）经过初代培养后，挑取疑似病原菌菌落，通过划线分离等方法进行纯化。确保用于AST的菌株为单一菌落，避免杂菌干扰。对于混合感染或难以分离的菌株，需结合标本类型、菌落形态、革兰染色及初步生化反应进行综合判断和处理。

（二）菌悬液的制备与浓度调整

1.挑取菌落：选择培养18-24小时（某些苛养菌除外）的纯培养菌落，挑取3-5个形态相似的典型菌落。

2.制备悬液：将挑取的菌落接种于适宜的无菌稀释液中（如无菌生理盐水或Mueller-Hinton肉汤），充分混匀，制成均匀的菌悬液。

3.浓度调整：采用麦氏比浊法或自动化比浊仪将菌悬液浓度调整至特定麦氏单位（通常为0.5麦氏单位，约相当于10^8CFU/mL）。调整后的菌悬液应在规定时间内（通常15-30分钟）使用，以避免细菌浓度因繁殖或死亡而发生显著变化。对于某些生长缓慢或特殊的菌株，菌悬液的制备和浓度要求可能有所不同，需参照相应标准执行。

（三）药敏方法的选择与操作

根据实验室条件、菌株类型及临床需求，选择合适的AST方法。常用的方法包括纸片扩散法（K-B法）、稀释法（肉汤稀释法、琼脂稀释法）及自动化仪器法。

1.纸片扩散法（K-B法）：

*培养基制备：将Mueller-Hinton（MH）琼脂加热融化，冷却至45-50℃时倾注平板，厚度控制在4±0.5mm。待琼脂凝固后，置于2-8℃冰箱保存，通常不超过一周。使用前需将平板平衡至室温。

*接种：用无菌棉拭子蘸取调整好浓度的菌悬液，在管壁上挤压去除多余液体后，均匀涂布于MH琼脂平板表面，通常分三个方向涂布，确保均匀覆盖整个琼脂表面。涂布后将平板置于室温干燥3-5分钟，待琼脂表面菌液吸收且无明显液体残留。

*贴纸片：使用无菌镊子或专用纸片分配器，将选定的抗菌药物纸片均匀贴在琼脂表面，各纸片中心间距应不小于24mm，纸片边缘距平板边缘应不小于15mm。轻压纸片确保与琼脂完全接触。

*孵育：将平板倒置（防止冷凝水滴落），置于35±2℃孵育箱中孵育16-18小时（苛养菌需特殊条件和时间）。

2.稀释法：

*肉汤稀释法：将抗菌药物在无菌的MH肉汤中进行系列稀释，制备成不同浓度梯度。然后在每个浓度管中接种一定量的标准化菌悬液，经孵育后观察细菌生长情况，以无细菌生长的最低药物浓度为最低抑菌浓度（MIC）。

*琼脂稀释法：将不同浓度的抗菌药物与融化并冷却至45-50℃的MH琼脂混合，倾注平板。待凝固后接种标准化的菌悬液（通常为点状接种），孵育后观察菌落生长情况，判读MIC。

*稀释法是AST的参考方法，尤其适用于研究目的或对纸片法结果有疑问时。

3.自动化仪器法：

*自动化药敏系统通常整合了菌悬液制备、接种、孵育、读数和结果判读等步骤，通过比浊、荧光或显色反应等原理测定MIC值或判读敏感、中介、耐药（S/I/R）结果。

*操作人员需严格按照仪器说明书进行操作，包括菌悬液浓度的调整、加样体积、孵育条件等，并确保仪器处于良好运行状态。

（四）结果判读与报告

1.纸片扩散法：孵育结束后，使用游标卡尺或专用测量工具，精确测量抑菌圈直径