5、miRNA经典流程材料.docxVIP

构建深静脉血栓大鼠模型收集患病/高危/正常外周血样本发色底物法检测AT-III、ALT、PAI等

构建深静脉血栓大鼠模型

收集患病/高危/正常外周血样本

发色底物法检测AT-III、ALT、PAI等

分析miR-XX与XX、NF-κB含量的相关性，miR-XX与各临床指标参数的相关性

基因芯片筛选血栓中差异性表达的miRNA

锁定研究对象：miR-XXX

在线网站预测与XXX存在结合位点的miRNA

选择与凝血机制密切相关的基因XXX

动物水平上明确miR-XX影响深静脉血栓溶解再通的调控机制

尾静脉注射miR-XXagomir

血栓前状态分子标志物的检测：

ELISA检测血浆中XX、APC、E-选择素等；

凝固法检测血浆中AT-III、D-D等;

放免法检测血浆中6-Keto-PGF1a和TXB2等

qRT-PCR和Westernblot检测：

上清液XXPI、TM、PKC、tPA、PAI-1、VCAM-1、ICAM-1、E-选择素等表达

MTT法检测细胞增殖

凝固法检测FBG、TT、PT、aPTT等

ELISA检测XXX、vWF和t-PA等

免疫法检测D-D；

其他指标检测（WBC、PLT、MPV、PDW、GMP-140等）

qRT-PCR检测miR-XX、XX、NF-κB和SP1表达

临床上探究miR-XXX与深静脉血栓的相关性

血栓组织称重，HE染色和透射电镜观察血栓再通情况

血管内皮细胞功能指标检测：

血浆中APC、sICAM-1、vWF检测

qRT-PCR和Westernblot检测：

血栓组织中miR-XX、XX、NF-κB、APC、sICAM-1、vWF等表达

细胞水平上阐明miR-XX直接或间接靶向XX在深静脉血栓中的具体机制

双荧光素酶实验验证miR-XX与XX的靶向关系

miRNP-IP分析miR-XX与XX结合情况

干扰miR-XX、XX表达及NF-κB通路抑制剂处理

脐静脉内皮细胞（HUVEC）

单核细胞（THP-1）

Hoechst法检测各组细胞凋亡

一期凝固法测定总的细胞促凝活性

整理数据，撰写发表

qRT-PCR检测三者的表达以明确具体调控关系